中国被毛孢液体发酵培养条件优化

孙秀萍，赵兵，王晓东（中国科学院过程工程研究所，北京100080）

中国被毛孢液体发酵培养条件优化

孙秀萍，赵兵，王晓东*
（中国科学院过程工程研究所，北京100080）

摘要：以中国被毛孢为试验菌株，对药瓶发酵培养基配方和发酵条件进行优化。在单因素试验的基础上，进行正交试验，结果表明最佳发酵培养基配方：葡萄糖3%，蚕蛹粉2%，土豆20%，KH2PO40.2%，MgSO40.1%，水解酪蛋白0.1%，复合维生素0.07%。最佳摇瓶发酵条件：初始pH 6.5，装液量100 mL/500 mL，接种量为5%，温度为16℃，摇床转速150 r/min。菌丝体干重为16.53 g/L，腺苷含量为1.85 mg/g。与优化前相比，菌丝体干重提高了36.2%，腺苷含量提高了46.8%。

关键词：中国被毛孢；液体发酵；优化；腺苷含量

中药冬虫夏草为真菌界（Fungi）麦角菌科（Clvaieipiacteae）冬虫夏草属（Cordyceps）的冬虫夏草菌（C.sinensis（Berk．）Sacc．）寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体[1]。主产于四川、青海、西藏、云南、贵州等海拔3 500 m～5 000 m的高山草甸土中[2]。由于具有多种医疗作用，其需求量逐年增加，野生资源遭到掠夺式采集，濒临枯竭。梁宗琦、李增智等的研究表明，中国被毛孢（Hirsutella sinensis）是冬虫夏草的真菌无性型[3-6]。且研究发现，人工发酵冬虫夏草无性型得到的菌丝体与天然冬虫夏草化学组成及药理学作用基本一致，可用来代替天然冬虫夏草生产虫草制品，弥补自然资源的短缺[7-8]。腺苷作为冬虫夏草的主要有效成分之一，已收录入药典。为了提高液体发酵虫草的产量，本研究在单因素试验的基础上，采用正交试验，以菌丝体干重和腺苷含量为指标，对中国被毛孢菌丝体液体发酵的培养基及培养条件进行优化。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1试验菌株

中国被毛孢菌种：购自贵州益生原生物技术有限公司，从青海天然冬虫夏草中分离得到。

1.1.2培养基

斜面培养基：PDA培养基；种子培养基：葡萄糖2%，蛋白胨1%，土豆20%，KH2PO40.2%，MgSO40.1%，水解酪蛋白0.1%，复合维生素0.1%，pH 5.5～6.0；原液体培养基（基础培养基）：葡萄糖2%，蛋白胨1%，土豆20%，KH2PO40.2%，MgSO40.1%，水解酪蛋白0.1%，复合维生素0.1%，pH 5.5～6.0。初始培养条件：转速150 r/min，培养温度为17℃，接种量为5%。

1.1.3试剂

腺苷标准品：购自中国食品药品检定研究院，纯度＞98%。

1.2方法

1.2.1母种和种子液的制备

1.2.1.1母种的制备

在超净台中将菌丝体接种至固体斜面后，放入17℃的培养箱中培养，至菌种长满整个斜面后再放入4℃的冰箱中储存备用。

1.2.1.2种子液的制备

在超净台中将母种挑取一块转入种子培养基中，放入17℃的摇床中，培养7 d～10 d。

1.2.2中国被毛孢的菌体生长曲线

取液体培养72 h的种子液，以5%接种量接入基础发酵培养基，在温度为17℃和转速为150 r/min的摇床中培养，每隔24 h取样测定菌丝体干重和腺苷得率，得到生长曲线，对菌体进行生长规律初步探索。

1.2.3菌体干重的测定方法

在超净台中，从摇瓶中取出10 mL的样品，在10 000 r/min下离心20 min，去上清液，将离心管中的菌丝转移到已称取重量的培养皿中，放于48℃的烘箱中烘干至恒重，然后取出称取样品和皿重，总重减去皿重即可得到菌丝体的重量。然后将皿中的菌丝收集于1.5 mL的离心管中置于4℃的冰箱中，留待以后测定样品中的有效成分。

1.2.4.2腺苷标准曲线的制作

精密称取腺苷标准品0.25、0.5、1、2、3、4、5 mg，分别置于50 mL容量瓶中，加100%甲酵溶液使溶解并稀释至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，进样20 μL，记录色谱图，计算峰面积值，以峰面积对浓度进行回归，得到回归方程。

1.2.4.3样品中腺苷含量测定

用分析天平精确称取菌丝体干粉0.100 0 g置于15 mL的离心管中，加入4 mL的去离子水，混匀，在100 W、40 KHz及35℃的超声清洗仪器中进行细胞破碎30 min。将离心管在7 000 r/min的条件下离心6 min，弃沉淀将上清液定容至5 mL。按照上述液相条件进行液相分析，从而求得腺苷的含量。

1.2.5碳源对菌种发酵的影响

1.2.5.1碳源种类对菌种发酵的影响

在基础培养基中去除葡萄糖，分别选用等量的葡萄糖、可溶性淀粉、白砂糖（食用级）、乳糖为碳源，第5天取样10 mL测其菌丝体干重和腺苷的得率以确定最佳碳源。

1.2.5.2碳源含量对菌种发酵的影响

选用葡萄糖来探究碳源含量对菌丝体发酵的影响，葡萄糖浓度依次为0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%，其他条件不变，第5天取样10 mL测其菌丝体干重和腺苷得率来确定碳源的最佳浓度。

1.2.6氮源对菌种发酵的影响

1.2.6.1氮源种类对菌种发酵的影响

在基础培养基中去除蛋白胨，分别选用等量的有机氮源蚕蛹水（取蚕蛹粉煮30 min，经四层纱布过滤得到蚕蛹水）、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉和无机氮源硫酸铵为氮源，第5天取样10 mL测其菌丝体干重和腺苷得率来确定最佳氮源。

1.2.6.2氮源含量对菌种发酵的影响

选用蛋白胨做氮源含量试验，蛋白胨浓度依次为0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%，第5天取样10 mL测其菌丝体干重和腺苷得率来确定氮源的最佳浓度。

1.2.7温度对菌种发酵的影响

温度是发酵过程中重要的影响因素，由于微生物的生长和产物的合成都是在各种酶的催化下进行的，而温度是保证酶活性的重要条件，因此发酵系统中，必须保证稳定而合适的温度环境。本研究设定发酵温度分别为13、15、16、17、18、21、25℃，其他条件不变，在基础培养基的基础上以菌丝体收率为指标第4天取样10 mL，从而得到最适发酵温度。

1.2.8不同起始pH对菌体发酵的影响

pH对于微生物的生长非常重要，它能影响微生物细胞膜内外两侧的电位及物质输送等，为了确定中国被毛孢合适的生长pH，设定了起始pH分别为3、4、5、5．5、6、6．5、7、7．5、8、9进行发酵，第4天取样10 mL测其菌丝体收率，从而得到最适起始pH。

1.2.9复合维生素含量对菌体发酵的影响

有文献报道，培养基中维生素的含量会影响菌丝体生长。为了确定合适的复合维生素含量，在基础培养基的基础上，设定不同的复合维生素含量0、0.01%、0.03%、0.05%、0.07%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%进行发酵，第5天取样10 mL测定菌丝体收率和腺苷得率，以确定合适的复合维生素含量。

1.2.10发酵培养基的正交试验

在生产实践和科学实验中，为了实现高产、优质、低消耗，往往要通过试验来寻找最优工艺条件，常用的方法是采用正交试验。为确定菌种摇瓶发酵培养基的最佳配方，将葡萄糖含量、蚕蛹粉含量、pH、复合维生素含量作为A、B、C、D四因素，每个因素取3个水平，以L9（34）正交表设计试验，3次平行。试验结果采用正交软件进行分析，从而得到最佳发酵培养基的配方。正交试验设计见表1。

表1正交试验设计Table 1　The design of orthogonal experiment

2　结果与分析

2.1菌体生长曲线

每隔24 h取一次样，然后测定菌丝体的干重和腺苷含量，制作菌丝体的生长曲线。

图1 中国被毛孢生长曲线Fig.1　Growth curve of Hirsutella sinensis

从图1可以看出，从0至12 h为适应期，12 h至72 h为对数生长期，72 h至216 h为稳定生长期，而且当发酵时间为96 h时，菌丝体收率最大，此后菌丝体的干重变化不大，直至菌丝体生长至240 h，菌丝体干重有所下降。腺苷含量随着发酵的进行迅速增加，当生长到120 h之后腺苷含量达到最大，随后腺苷含量缓慢下降，初步估计是培养基中的氮源不足以满足菌种生长的需要，而腺苷开始作为氮源使用，而当腺苷等含氮物质消耗殆尽时，菌丝体的含量也开始出现了明显的下降。

2.2腺苷含量的测定

腺苷为冬虫夏草的重要质控指标，药典中规定其含量不得少于0.01%，腺苷标准品的色谱图如图2，虫草菌丝体样品的色谱图如图3。

图2腺苷标准品的HPLCFig.2　HPLC of standard sample of adenosine

图3菌丝体的HPLC Fig.3　HPLC of mycelia

通过对比标准品和样品的谱图可以得到相对应的腺苷峰。以浓度X和峰面积Y进行回归，得到腺苷的标准曲线图4。

图4腺苷标准曲线Fig.4　The standard curve of adenosine

回归方程为：Y=47 417X-182 835，r2=0.9964>r0.014= 0.917，表明X和Y相关关系极显著。

2.3单因素试验

2.3.1碳源对菌体发酵的影响

2.3.1.1碳源种类的影响

保证原液体培养基中其它成份不变，改变培养基中碳源的种类，经过摇瓶发酵以确定中国被毛孢生长的最适碳源。碳源种类对菌丝体发酵的影响如图5。

图5　碳源种类对菌丝体发酵的影响Fig.5　The effect of different carbons on the fermentation of mycelia

由图5可以得出，葡萄糖和可溶性淀粉作为碳源时，菌丝体干重要比白砂糖和乳糖作为碳源时高；而葡萄糖作为碳源时腺苷含量要比其他几种碳源高。综合考虑，选用葡萄糖作为碳源。

2.3.1.2碳源含量对菌丝体发酵的影响

保证原液体培养基中其它成份不变，改变培养基中葡萄糖的含量，经过摇瓶发酵后，确定中国被毛孢生长的最适碳源含量，试验结果见图6。

图6　碳源含量对菌丝体发酵的影响Fig.6　The effect of concentration of carbon on the fermentation of mycelia

由图6可看出，菌丝体的干重和腺苷含量均随着发酵时间，先增大后又减少，其中在葡萄糖含量为3.00%时菌丝体干重和腺苷含量均达到最大，故葡萄糖含量为3.00%时对菌丝体发酵最有利。

2.3.2氮源对菌体发酵的影响

2.3.2.1氮源种类对菌丝体发酵的影响

保证原液体培养基中其它成份不变，改变培养基中氮源的种类，经过摇瓶发酵后，确定了中国被毛孢生长的最适碳源，试验结果见图7。

图7　氮源种类对菌丝体发酵的影响Fig.7　The effect of different nitrogens on the fermentation of mycelia

由图7可以得出，有机氮源要比无机氮源更有利于菌体的生长。蚕蛹粉作为氮源时，菌丝体干重最高；蚕蛹粉和牛肉膏作为氮源时，氮源含量略高于酵母粉，但远高于蛋白胨和硫酸铵。综合考虑，选用蚕蛹粉作为氮源。

2.3.2.2氮源含量对菌丝体发酵的影响

保证原液体培养基中其它成份不变，改变培养基中蚕蛹粉的含量，经过摇瓶发酵后，确定中国被毛孢生长的最适氮源含量，试验结果见图8。

图8　氮源含量对菌丝体发酵的影响Fig.8　The effect of concentration of nitrogen on the fermentation of mycelia

由图8可看出，菌丝体的干重和腺苷含量均随着发酵时间，先增大后又减少，其中在蚕蛹粉含量为3.00%时菌丝体干重达到最大，在蚕蛹粉含量为2.50%时腺苷含量达到最大。

2.3.3起始pH对菌丝体发酵的影响

为了确定菌种生长的合适pH，采用了不同的起始pH，试验结果见图9。

由图9可以看出，随着起始pH升高，菌丝体收率先增加又降低，当起始pH为6.5时，菌丝体收率最高，pH高于7.5时，菌丝体收率明显下降，所以培养时选择起始pH为6.5；从发酵结束后的pH看，菌种对于碱性的调节能力非常强，可以从起始pH的9.0调节到6.5，但对酸性较强时的调节能力较差，其中起始pH为4.0和5.0的摇瓶经过发酵后分别变为4.08和5.25，pH几乎不变化，但当pH为5.5以上时，最终pH又能调节至6左右。

图9　不同起始pH对菌丝体干重的影响Fig.9　The effect of initial pH on the yield of mycelia

2.3.4温度对菌丝体发酵的影响

温度对菌丝体发酵的影响见图10。

图10　菌丝体干重随温度的变化Fig.10　The effect of different temperature on the yield of mycelia

由图10可以看出，菌丝体干重随着温度的升高先增大后减小，菌丝体干重在15℃～17℃之间差距不大，最终确定菌种的发酵温度为16℃，此时菌丝体的收率达到最大。

2.3.5复合维生素含量对菌体发酵的影响

复合维生素含量对菌体发酵的影响见图11。

由图11可以看出随着复合维生素含量的增加，菌丝体干重和腺苷含量先增加后减少，并且在0.07%时达到最大值。

2.4正交试验

为确定菌种摇瓶发酵培养基的最佳配方，在以上的单因素试验的基础上，选取对腺苷含量影响明显的因素设计正交试验。最后选取葡萄糖含量、蚕蛹粉含量、pH、复合维生素含量作为A、B、C、D四因素，每个因素取三个水平，以L9（34）正交表设计试验，试验结果采用DPS数据处理软件进行分析，从而得到最佳发酵培养基的配方。正交试验见表2，方差分析见表3。

图11　复合维生素含量对菌丝体发酵的影响Fig.11　The effect of concentration of multivitamin on fermentation of mycelia

表2　正交试验结果及极差分析表Table 2　Results of orthogonal experiment and analysis of its range

表3　正交试验的方差结果分析表Table 3　Analysis of variance of the orthogonal experiment

从表2极差大小可以看出，影响腺苷含量的各因素主次顺序为：A＞D＞C＞B。方差分析数据表3可得，F碳源含量＞F0.10=3.11，可见A因素对腺苷含量影响显著，所以对该因素应控制在最优水平上。而B、D、C因素F氮源含量＜FpH＜F复合维生素含量＜F0.10=3.11，即B、C、D对腺苷含量影响不显著，对结果影响不大。综合以上分析，得到最佳培养基配方为A2B2C3D2。因在正交试验中9组实验中没有A2B2C3D2的组合，所以补做了这组实验，得到的腺苷含量为1.9388 mg/g，确实高于其它组合，故最终确定的最佳培养基配方为：葡糖糖含量为20 g/L，蚕蛹粉含量含量为30 g/L，pH为6.5，复合维生素含量0.7 g/L。

2.5优化培养基与基础培养基比较

优化培养基与基础培养基比较见表4。

表4　优化培养基与基础培养基对比Table 4　Comparison of optimized medium and initial medium

由表4可以看出，通过摇瓶培养的优化，菌丝体干重和腺苷含量均有了显著的提高，菌丝体干重高了36.2%，腺苷含量提高了46.8%。

3　结论

1）单因素试验结果表明：最佳氮源为蚕蛹粉，最佳碳源为葡萄糖，发酵初始pH为6．5，装液量100 mL/ 500 mL，接种量为5%，温度为16℃，复合维生素的含量以0.07%为最佳。

2）在单因素试验的基础上，进行了正交试验，结果表明最佳发酵培养基配方为：葡萄糖3%，蚕蛹粉2%，土豆20%，KH2PO40.2%，MgSO40.1%，水解酪蛋白0.1%，复合维生素0.07%。最佳摇瓶发酵条件：初始pH6.5，装液量100 mL/500 mL，接种量为5%，温度为16℃，摇床转速150 r/min。

3）在优化后的最佳培养条件下中国被毛孢菌丝体干重为16.53 g/L，腺苷含量为1.85 mg/g，与优化前的菌丝体干重12.14 g/L和腺苷含量1.26 mg/g相比，菌丝体干重高了36.2%，腺苷含量提高了46.8%。可见，通过培养基成分和培养条件的优化，使得菌丝体干重和腺苷含量都有了明显的提高。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.042

收稿日期：2014-02-25

作者简介：孙秀萍（1988—），女（汉），硕士，主要从事微生物发酵研究。

*通信作者：王晓东，中科院副研究员。

Optimization of Liquid Fermentation Conditions of Hirsutella Sinensis

SUN Xiu-ping，ZHAO Bing，WANG Xiao-dong*
（Institute of Progress Engineering，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100080，China）

Abstract：This study took the Hirsutella sinensis as the experimental strain，and optimized its medium component of the shaking flask fermentation and ferment condition.The results of orthogonal experiment，which was based on the results of signal factor experiment，were as follows.The optimal medium component：glucose was 3%，silkworm chrysalis powder was 2%，potato was 20%，KH2PO4was 0.2%，MgSO4was 0.1%，hydrolysis casein was 0.1%，multivitamin was 0.07%.The optimal fermentation condition：initial pH 6.5，liquid volume in flask was 100 mL/500 mL，inoculum concentration was 5%，the temperature was 16℃，shaker's rotating speeds was 150 r/min.Based on this medium and ferment condition，the mycelium yield was 16.53 g/L and the content of adenosine was 1.85 mg/g.Compared to the original ferment condition，the mycelium yield and content of adenosine increased by 36.2%and 46.8%，respectively.

Key words：Hirsutella sinensis；liquid fermentation；optimization；content of adenosine