丹桂花总黄酮超声辅助提取及抗氧化性的研究

陈培珍，刘俊劭，刘瑞来，葛小宝（福建省高校绿色化工技术重点实验室，武夷学院生态与资源工程学院，福建武夷山354300）

丹桂花总黄酮超声辅助提取及抗氧化性的研究

陈培珍，刘俊劭，刘瑞来，葛小宝
（福建省高校绿色化工技术重点实验室，武夷学院生态与资源工程学院，福建武夷山354300）

摘要：以干丹桂花为原料，利用超声辅助提取丹桂花中的总黄酮。研究超声时间、超声脉冲间隙时间、超声功率、料液比、乙醇浓度、提取温度等因素对丹桂花黄酮提取率的影响，并最终确定最佳工艺条件为：超声时间15 min，超声工作时间/超声间隙时间比为5∶2，超声温度60℃，料液比1∶30（g/mL），超声功率60 W，乙醇浓度40%。通过羟自由基和超氧阴离子自由基的清除实验，表明提取的黄酮具有和BHT相当的抗氧化活性。

关键词：丹桂；总黄酮；超声辅助提取；自由基；抗氧化

桂花（Osmanthus fragrans Lour）又名木犀、九里香、金栗，是我国十大传统名花之一，我国桂花主要有金桂、银桂、丹桂和四季桂四大品种群约100多个品种。福建省浦城县栽培丹桂历史悠久，被誉为丹桂之乡，现栽种面积突破0.4万公顷，居全国首位。桂花具有很高的经济价值，其花可以提取香料，也可熏制花茶。目前发现桂花中黄酮、蛋白质、脂肪含量非常丰富，也含多种维生素、微量元素、胡萝卜素、花青素等成分，作为食品具有清除体内毒素及通宿便、净化身心、平衡神经系统，达到提神的作用；还具有抗癌、祛风散寒、润脾醒胃、增进食欲及减肥之功效，利用桂花原料制备天然黄酮类抗氧化产品具有潜在应用价值[1-4]。

本研究利用干燥丹桂花为原料，采用超声波辅助提取法制备总黄酮类产品，并通过单因素试验确定其最佳提取工艺条件；同时，通过清除羟基自由基和超氧阴离子自由基试验，测定丹桂花总黄酮的清除率，评价桂花总黄酮对自由基的清除能力，为丹桂花黄酮的提取、保健等资源综合开发与利用提供理论依据。

1　主要仪器与材料

UV-2550紫外可见分光光度计：日本Shimadzu公司；BILON-500超声波萃取仪：上海比朗仪器有限公司；RT-04药材粉碎机：浙江武义屹立工具有限公司。

无水乙醇、无水乙醚、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、过氧化氢、邻苯三酚、芦丁、BHT（2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚）、水杨酸等：试剂均为AR；三羟甲基氨基甲烷：生化试剂；丹桂花系由福建浦城木犀园营养食品有限公司提供。

2　试验方法

2.1样品的预处理

将干桂花，用粉碎机粉碎，过60目筛，称取15.00g，装入索氏脂肪提取器，按料液比1∶20（g/mL），以无水乙醇脱脂肪和色素2 h，得到处理后的桂花粉末放入真空干燥箱中60℃烘24 h，装于棕色磨口试剂瓶中备用。

2.2桂花黄酮含量的测定

2.2.1标准曲线制作

黄酮含量的测定采用NaNO2-Al（NO3）3分光光度法[5-6]。

准确配制芦丁标准液0.505 mg/mL于50 mL容量瓶中，准确移取0、1、2、4、6、8、10 mL至50 mL的容量瓶中，加60%乙醇溶液补充至12mL，加入5%亚硝酸钠1.4 mL，摇匀，放置5 min后加入10%的硝酸铝1.4 mL，摇匀，放置5 min后加入4%的氢氧化钠10 mL，摇匀，用60%乙醇溶液定容至50 mL，30 min后，在400 nm～800 nm波长范围内扫描，确定508 nm处为最大吸收波长，测定芦丁溶液的吸光度，以二次水作空白参比。以芦丁的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程y=11.419х-0.006 9，R2=0.999 7。

2.2.2桂花总黄酮的超声辅助提取及含量的测定[7-9]

准确称取一定质量预处理后的丹桂粉末于超声反应器中，在一定的超声时间、工作/间歇时间比、乙醇浓度、功率、温度、料液比等因素处理后，经过减压抽滤得到提取液，准确吸取0.25 mL提取液于25 mL容量瓶中，按2.2.1的操作方法测定吸光度y，根据回归方程，得到丹桂总黄酮浓度x，按下式计算总黄酮提取率：

提取率/%=（xV/m）×100

式中：V为提取液的总体积，mL；m为称量桂花的准确质量，g。

2.3羟自由基清除活性

利用Fenton反应[10]，H2O2与Fe2+混合产生·OH，当在体系中存在水杨酸情况下就能捕捉·OH，延长其存在时间，并产生有色产物，该产物在波长510 nm左右有强吸收，若在反应体系中加入具有清除·OH功能的物质，就会和水杨酸争夺·OH，而使有色产物的生成量减少，这样，我们可以利用在此条件下测定体系的吸光度值（此值可作为清除一定量的羟基自由基的A值）来测定黄酮类化合物对羟基自由基的清除效率。在25 mL的比色管中依次移取2 mL的2 mmol/L硫酸亚铁溶液和2 mL的6 mmol/L双氧水溶液，加入5 mL不同浓度的提取液，混合均匀后用6 mmol/L水杨酸的乙醇溶液定溶至刻度。在36℃～37℃的恒温水中反应15 min后在分光光度计上测其A值。

样品自由基的清除率可根据下式进行计算：

式中：A0为空白对照液吸光度，A0值的测定（以纯水为参比）；AX为加入一定体积的提取液后的吸光度；AX0为本底吸光度。

2.4超氧阴离子自由基清除能力的检测[11]

取0.05 mol/L，pH=8.2的Tris-HCL缓冲液于4.5 mL置于10 mL干燥具塞比色管中，在25℃水浴中预热20 min，分别加入配好的样品溶液，然后加入0.4 mL的25mmol/L邻苯三酚，混匀后，在25℃水浴中反应4min，立即加入2滴8 mol/L HCl终止反应，以蒸馏水为空白，在327 nm处测定吸光度A。

其清除效率可根据下式进行计算：

式中：A0为空白的吸光度值；Ai为样品的吸光度值。

3　结果与分析

3.1浸提方法的比较

准确称取脱脂后的干丹桂样品2 g用60%乙醇溶液，在料液比1∶30（g/mL）、温度50℃、提取时间30 min的条件下进行试验，分别以直接浸提法、连续超声波辅助提取法（超声功率60 W）和脉冲超声波辅助提取法（超声功率60 W，超声工作时间5 s，间隙时间1 s）进行提取，比较总黄酮的提取率，试验结果如图1所示。

图1　浸提方法的比较Fig.1　Comparison of extraction method

结果表明超声辅助法对桂花黄酮的提取有显著地提升效果，脉冲超声比连续超声提取的效果更好。

3.2超声提取桂花中总黄酮试验结果与分析

3.2.1超声时间/间隙时间比对提取率的影响

准确称取样品5份2.00 g的样品于反应器内，加60%乙醇60 mL[料液比 1∶30（g/mL）]，用超声功率60 W，温度50℃，分别以25 min（5 s/1 s、5 s/2 s、5 s/3 s、5 s/4 s、5 s/5 s）的超声波条件进行提取，过滤取得上清液，测定总黄酮含量，结果见图2。

图2　超声间隔时间比对黄酮提取率的影响Fig.2　Effect of ultrasonic time interval on yield of flavonoids from Osmanthus fragrans var aurantiacus

可以看出在超声工作时间5 s，间歇时间2 s条件下提取效果较好，超声强化萃取主要由空化作用和机械作用共同强化的效果，相对于连续超声，脉冲超声不断重复超声的产生和停歇，对植物的细胞产生不断拉伸和收缩的过程，加大对细胞膜和细胞壁的破坏程度，能够更大提高提取效率。过大的间歇时间使超声作用的实际时间减少也不利超声的作用。

3.2.2超声时间对提取率的影响

准确称取5份2 g的样品，加入60%乙醇60 mL，在超声功率60 W，温度50℃，工作间歇时间比5 s/2 s条件下，分别以5、10、15、20、25、30 min的超声时间进行丹桂总黄酮的提取并测其含量，结果见图3。

图3　超声时间对提取率的影响Fig.3　Effect of ultrasonic time on yield of flavonoids from Osmanthus fragrans var aurantiacus

结果如图所示当提取时间大于15 min后提取率的变化明显趋缓，表明提取接近完全，过分增大提取时间导致部分黄酮分解，致使提取率下降，故取提取时间为15 min。

3.2.3超声功率对提取率的影响

准确称取5份2.00g的样品，加入60%乙醇60mL，在温度50℃，超声时间15 min，工作间歇时间比5 s/2 s的条件下，分别以40、60、80、100、120 W的超声功率进行丹桂总黄酮的提取并测其含量，结果见图4。

图4 超声功率对提取率的影响Fig.4　Effect of ultrasonic power on yield of flavonoids from Osmanthus fragrans var aurantiacus

由图4可见，随着超声功率的升高，黄酮提取率随之升高，功率达到60 W时，黄酮提取率最大。继续增大功率，总黄酮提取率下降。这可能因为超声功率增大，黄酮分子内结构被破坏，导致黄酮含量的降低。

3.2.4料液比对提取率的影响

准确称取5份2 g的样品，加入一定量的60%乙醇，设定料液比（g/mL）为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，在温度50℃，超声功率60 W，超声时间15 min，工作间歇时间比5 s/2 s的条件下，进行丹桂总黄酮的提取并测其含量，结果见图5。

图5　料液比对提取率的影响Fig.5　Effect of ratio of material to solvent on yield of flavonoids from Osmanthus fragrans var aurantiacus

由图5可看出，在料液比为1∶10（g/mL）～1∶30（g/mL）内，总黄酮提取率随着料液比的增大而提高，当料液比大于1∶30（g/mL）后，提取率开始下降这是因为原料量一定时，溶剂用量大，在提取中随着溶剂用量的提高黄酮的浓度较小，黄酮容易从原料中扩散到溶液中，随着溶剂用量继续增大，溶度变化影响减小，溶剂量的增大增加了超声波破碎细胞的阻力，从而使黄酮的提取率降低。

3.2.5乙醇浓度对提取率的影响

准确称取5份2 g的样品，分别加入浓度为30%、40%、50%、60%、70%（体积分数）的乙醇60 mL，在温度50℃，超声功率60 W，超声时间15 min，工作间歇时间比5 s/2 s的条件下，进行黄酮的提取并测其含量，结果见图6。

图6 乙醇浓度对提取率的影响Fig.6　Effect of ethanol concentration on yield of flavonoids from Osmanthus fragrans var aurantiacus

由图6可以看出，提取率随乙醇浓度的增加先增加后减少。黄酮是一大类物质，部分是水溶性的，部分是醇溶性的[12]，许多学者认为植物黄酮类化合物在乙醇溶液的溶解与其极性有关[13-15]，当乙醇溶液的极性与植物黄酮类化合物的极性相似时具有较高的提取率。可能因丹桂样品中的黄酮类化合物与40%～50%乙醇浓度的极性相近，故能得到较高的提取率。

3.2.6提取温度对提取率的影响

准确称取5份2 g的样品，加入40%乙醇60 mL，在超声功率60 W，超声时间15 min，工作间歇时间比5 s/2 s的条件下，分别以30、40、50、60、70℃的超声温度进行丹桂总黄酮的提取并测其含量，结果见图7。

试验结果可知温度由30℃升到50℃提取率有较为明显的升高，大于50℃提取率变化趋缓，当高温时提取率反而下降，这可能是因为在一定温度范围内升高温度有利于黄酮的溶出；在温度较高时可能导致黄酮的水解或变性。

3.3桂花黄酮提取物抗氧化性能测定

3.3.1羟基自由基的清除

丹桂黄酮提取物和用作阳性对照的BHT对羟基自由基的清除能力对比试验，分别准确移取1、2、4、6、8、10 mL丹桂总黄酮提取液及浓度为6 mg/mL的BHT溶液至25 mL容量瓶中，稀释至刻度，根据2.3方法测定丹桂总黄酮对羟基自由基的清除率，结果见图8。

图7　超声提取温度对提取率的影响Fig.7　Effect of ultrasonic temperature on yield of flavonoids from Osmanthus fragrans var aurantiacus

图8　丹桂黄酮对羟基自由基的清除作用Fig.8　Hydroxyl radical scavenging effect of flavonoid glycoside from Osmanthus fragrans var aurantiacus

测定结果如图8所示，可知：提取物和BHT的抗氧化活性都随着浓度的增加而提高。BHT比提取物清除羟基自由基的能力略高。

3.3.2超氧阴离子的清除

分别移取丹桂总黄酮和6 mg/mLBHT溶液0.025、0.05、0.075、0.1、0.125 mL于2 mL比色管中，定容；根据2.4方法二测定丹桂总黄酮和BHT对超氧阴离子的清除率，试验结果见图9。

由样品提取物和BHT对超氧阴离子的清除效果比较来看，提取物对超氧阴离子的清除能力要好于此浓度下BHT的清除能力。

4　结论

采用超声辅助溶剂法提取丹桂花总黄酮，以提取率为评价指标，对提取工艺条件进行试验研究，确定丹桂总黄酮较佳提取工艺条件为：超声时间15 min，超声工作时间5 s，超声间隙时间2 s，以40%乙醇为提取溶剂，提取料液比1∶30（g/mL），提取温度50℃，超声功率为60 W，在此条件下丹桂总黄酮得率可达17.70%。

通过羟基自由基、超氧阴离子自由基体外抗氧化模型的试验研究，研究结果表明：丹桂黄酮抗氧化活性随浓度的升高而增大，在清除羟基自由基试验中，丹桂黄酮的清除能力略低于BHT，而对超氧阴离子清除能力由于BHT，可以看出丹桂花黄酮具有潜在开发价值的天然抗氧化剂。

图9　丹桂黄酮对超氧阴离子的清除作用Fig.9　Superoxide anion radical scavenging effect of flavonoidglycoside from Osmanthus fragrans var aurantiacus

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.012

收稿日期：2014-08-13

基金项目：武夷学院对接南平产业发展科研专项（2011DJ10）

作者简介：陈培珍（1968—），女（汉），副教授，硕士，研究方向：天然产物的提取及其分析。

Study on Ultrasonic-assisted Extraction of the Total Flavonoids in Osmanthus Fragrans Var Aurantiacus and Its Antioxidative Activity

CHEN Pei-zhen，LIU Jun-shao，LIU Rui-lai，GE Xiao-bao
（College of Ecological and Resources Engineering，Key Laboratory of Green Chemical Technology of Fujian Province University，Wuyi University，Wuyishan 354300，Fujian，China）

Abstract：The extraction of flavonoids from dry Osmanthus fragrans var aurantiacus with ultrasonic wave was studied.With extraction rate as an index，ultrasonic extracted time，pulse ultrasonic intermittent time，ultrasonic power，material/extraction solution ratio，ethanol concentration and ultrasonic extracted temperature etc.The optimum extraction condition were as follows：ultrasonic extracted time 15 min，ultrasonic pulse duration time 5 s，pulse interval time 2 s，ultrasonic power 60 W，material/extraction solution ratio 1∶30（g/mL），ethanol concentration 40%and ultrasonic extracted temperature 60℃.The antioxidative activity was evaluated based on hydroxyl free radical and surperoxide anion radical scavenging capacity.The results showed that flavonoid from Osmanthus fragrans var aurantiacus and BHT had the same antioxidant activity.

Key words：Osmanthus fragrans var aurantiacus；total flavonoids；ultrasonic-assisted extraction；radical；antioxidation