河豚鱼皮胶原寡肽的毒理学安全性评价

郭洪辉，王安，洪专，*（.国家海洋局第三海洋所，海洋生物资源综合利用工程技术研究中心，福建厦门36005；.中南大学公共卫生学院卫生毒理学系，湖南长沙40083）

河豚鱼皮胶原寡肽的毒理学安全性评价

郭洪辉1，王安2，洪专1，*
（1.国家海洋局第三海洋所，海洋生物资源综合利用工程技术研究中心，福建厦门361005；2.中南大学公共卫生学院卫生毒理学系，湖南长沙410083）

摘要：以河豚鱼皮作为原料，采用两步酶解法制备河豚鱼皮胶原寡肽，分子量分布主要集中在100 u～1 000 u。根据《食品安全性毒理学评价程序和方法》和《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》的要求，利用动物试验对河豚鱼皮胶原寡肽的安全性进行评价。急性经口、经皮毒性试验选用SD大鼠，大鼠经口LD50＞5 000 mg/kg，经皮LD50均＞2 000 mg/kg；皮肤、眼刺激试验选择健康白色家兔，皮肤刺激强度平均分值为0，平均眼刺激积分指数（I.A.O. I）为0，眼刺激平均指数（M.I.O.I）48 h为5。皮肤变态反应（致敏）试验选用豚鼠，致敏强度为Ⅰ级。

关键词：河豚；胶原寡肽；急性毒性试验；毒理学；安全性评价

胶原肽是胶原蛋白的水解产物，研究发现，胶原肽具有多种生理调节功能，如改善皮肤水分、促进伤口愈合、抗皮肤老化[1]、抗氧化、抗高血压[2]、降血脂[3]等，已在化妆品、保健食品、医药卫生等领域显现出良好的应用前景。海洋生物尤其是海洋鱼类的皮肤、鳞片及骨正成为胶原肽的新的主要来源[2，4]。近年来，利用鱼皮等下脚料，制备出具有各种生理功能的胶原肽已有文献报道[5-10]，但鲜见有对胶原肽进行毒理学安全性评价报告。本文在以河豚鱼皮为原料制备胶原寡肽的基础上，对其进行毒理学安全性评价，了解胶原寡肽急性经口、经皮的毒性效应，观察胶原寡肽对眼、皮肤的刺激或腐蚀作用大小以及对皮肤变态反应性，初步估测毒作用的靶器官和可能的毒作用机理，为亚慢性、慢性和其他毒性试验的剂量设计提供参考，为河豚鱼皮胶原寡肽用作护肤用品或保健品的功能性因子的开发方面提供试验研究基础。

1　材料与方法

1.1试剂

河豚鱼皮：购于福建漳州水产品加工厂；Superdex peptide 10/300GL凝胶分析柱：美国GE公司；鱼鳞鱼皮胶原蛋白水解专用酶（105U/g）、酸性蛋白酶（104U/g）：南宁庞博生物工程有限公司；蛋白标准物质：美国sigma公司；Epsilon 2-6D冻干机：德国Christ公司。

1.2仪器

30L双层玻璃反应釜、DFY-20L/20低温恒温反应浴：巩义市予华仪器有限责任公司；Milli-Q超纯水纯化系统：美国Millipore公司；管式离心机：上海浦东天本离心机有限公司；SG2便携式pH计：梅特勒-托利多仪器上海有限公司；AKTA全自动蛋白层析系统：美国GE公司。

1.3试验动物

受试动物购自湖南省天勤生物技术有限公司，试验动物生产许可证：SCXK（湘）2009-0012号。试验前常规检疫1周后，选择符合要求的动物投入试验。急性经口、经皮毒性试验选用SD大鼠，体重为180 g～220 g，雌雄各半；皮肤、眼刺激试验选择健康白色家兔，体重2.0 kg～2.5 kg，雌雄各半。皮肤变态反应（致敏）试验选用豚鼠40只，体重250 g～300 g，雌雄各半。

1.4河豚鱼皮胶原寡肽的制备[11]

5 kg河豚鱼皮，依次采用酸碱液处理后，洗至中性，加入5 L纯水，60℃恒温加热搅拌提取2 h后，冷却至室温，以管式离心机过滤除渣，得到河豚鱼皮的胶原提取液。胶原提取液分别经鱼鳞鱼皮胶原蛋白水解专用酶和酸性蛋白酶两次酶解后，得到河豚鱼皮胶原寡肽提取液，冻干后为淡黄色的河豚鱼皮胶原寡肽粉末。

1.5河豚鱼皮胶原寡肽的分子量测定

采用AKTA全自动蛋白层析系统对胶原寡肽的分子量分布进行测定。以50 mmol/L磷酸盐、0.15mol/L氯化钠、pH 7.0的缓冲液为流动相，流速0.5 mL/min，进样量50 μL。图1为5种标准蛋白的分子量分布图。

图1　标准蛋白的分子量分布Fig.1　Molecular weight distribution of standard proteins

采用标准蛋白分子量的对数值对洗脱体积做标准曲线，得到回归方程：lgMr=-0.246v+6.669 7（R2= 0.995 9），式中：v为洗脱体积；Mr为分子量。通过洗脱体积计算胶原寡肽的分子量分布，并用峰面积归一法计算不同分子量范围肽的相对百分比。

1.6成分测定

取河豚鱼皮胶原寡肽冻干粉，测定其基本成分。蛋白含量的测定：GB5009.5-2010《食品中蛋白质的测定》；灰分的测定：GB 5009.4-2010《食品中灰分的测定》；水分的测定：GB 5009.3-2010《食品中水分的测定》。

1.7动物试验方法[12-13]

1.7.1急性经口毒性试验

测定最大耐受剂量，按5 000 mg/kg体重染毒。取SD大鼠20只，体重（187.72±3.95）g，雄雌各半，隔夜禁食。取适量受试物用蒸馏水配成所需浓度溶液，一次灌胃给药，观察动物给药后14 d的中毒症状及死亡情况。

1.7.2急性经皮毒性试验

根据预试验结果，正式试验测定最大耐受剂量，按2 000 mg/kg体重染毒。取SD大鼠20只，体重（223.53±3.45）g，雌雄各半，给药前24 h将大鼠背部去毛，面积为4cm×5cm。直接涂敷受试物于去毛区，持续时间为4 h，观察给药后14 d的中毒症状及死亡情况。

1.7.3急性皮肤刺激试验

白色家兔4只，雌雄各半，体重（2.5±0.1）kg，试验前24 h将家兔背部两侧的毛剪去，左右两侧去毛面积均约2 cm×3 cm，以左侧为涂药区，右侧为对照区。分别取0.5 g受试物，用少许蒸馏水润湿涂敷于涂药区，持续时间为4 h。对照区涂以等量蒸馏水。处理后观察皮肤刺激反应，观察期一般不超过14 d。

1.7.4眼刺激试验

白色家兔4只，雌雄各半，体重2.0 kg～2.5 kg，以左眼为给药眼，右眼为对照眼。分别取受试物0.1 g，撒入动物左眼结膜囊内，立即轻轻闭合眼睑约1 min；对照眼给予等量生理盐水。观察动物受药后1、24、48、72 h眼结膜、虹膜和角膜的刺激损伤和恢复情况。

1.7.5皮肤变态反应（致敏）试验

豚鼠20只，体重250 g～300 g，分为染毒组、阴性对照组和阳性对照组，每组10只，雌雄各半。致敏接触：试验前24 h将动物背部左侧去毛3 cm×3 cm，分别取受试物0.2 g，用少许蒸馏水润湿敷贴于去毛区，持续6 h，第7天和14天以同样方法重复一次；激发接触：试验前24 h将动物背部右侧去毛2 cm×2 cm，末次致敏后14 d，取受试物0.1 g，用少许蒸馏水润湿敷贴于去毛区，持续6 h，每日观察至第12天。阴性对照组仅给予激发接触。

2　结果与讨论

2.1分子量及成分分析

图2为河豚鱼皮胶原寡肽的分子量分布图。

图2　河豚鱼皮胶原寡肽的分子量分布Fig.2　Molecular weight distribution of collagen peptides from puffer fish skin

从图2中可以看到，制备的河豚鱼皮胶原寡肽的分子量集中分布在100 u～1 000 u之间。经测定，胶原寡肽冻干样品的蛋白含量为87.3%，灰分为1.1%，水分为3.88%。

2.2安全性试验

2.2.1急性经口毒性试验

经口给药后，河豚鱼皮胶原寡肽对SD大鼠急性经口毒性试验结果如表1所示。

表1 胶原寡肽对SD大鼠急性经口毒性试验结果Table 1　Results of acute oral toxicity tests of collagen oligoeptide on SD rats

受试大鼠未见异常，在14 d观察期内受试大鼠无死亡及其它异常，雌、雄性大鼠经口LD50＞5 000 mg/kg（表1）。

2.2.2急性经皮毒性试验

表2为河豚鱼皮胶原寡肽对SD大鼠急性经皮毒性试验结果。

表2 胶原寡肽对SD大鼠急性经皮毒性试验结果Table 2　Results of acute dermal toxicity tests of collagen oligoeptide on SD rats

从试验结果可以看到，经皮给药后，受试大鼠未见明显异常，在14 d观察期内受试大鼠无死亡及其它异常。雌、雄性大鼠经皮LD50均＞2 000 mg/kg（表2）。

2.2.3皮肤刺激试验结果

给药4 h后动物涂药区局部皮肤未见红斑、水肿。在7 d观察期内动物均无其他异常现象。皮肤刺激强度平均分值为0，对照区无异常现象。

2.2.4眼刺激试验结果

给药后1 h，动物受药眼未见结膜充血、水肿，无分泌物，观察至给药后72 h，受药眼未见异常。平均眼刺激积分指数（I.A.O.I）为0，眼刺激平均指数（M.I.O.I）48 h为5；对照眼无异常。

2.2.5皮肤变态反应（致敏）试验

试验组所有动物局部皮肤均未出现红斑和水肿，动物皮肤致敏率为0%，致敏强度为Ⅰ级。阳性对照组（2-4-二硝基氯代苯）受试动物皮肤涂药区可见红斑、水肿，个别动物出现皮肤溃烂，动物皮肤致敏率为100%，致敏强度为Ⅴ级。阴性对照组动物无异常反应（表3）。

表3　胶原寡肽对豚鼠皮肤致敏试验结果Table 3　Results of dermal allergy reaction of collagen oligoeptide on guinea pigs

3　结论

以河豚鱼皮作为原料，先用酸碱进行预处理后进行提取，再用两步酶解法制备得到的河豚鱼皮胶原寡肽分子量分布主要分布在100 u～1 000 u之间。虽然河豚鱼中含有剧毒物质河豚毒素[14]，但是河豚鱼皮制备的胶原寡肽急性经口、经皮毒性均属低毒，雌、雄性大鼠经口LD50＞5 000 mg/kg，雌、雄性大鼠经皮LD50＞2 000 mg/kg；对家兔皮肤、眼睛无刺激性，致敏强度为Ⅰ级。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.044

收稿日期：2014-12-30

基金项目：福建省科技计划项目（2014N0013）；福建省科技重大专项（2014NZ0001-2）

作者简介：郭洪辉（1982—），女（汉），助理研究员，博士，主要从事海洋生物资源综合利用研究。

*通信作者

Toxicology and Safety Evaluation of Collagen Oligopeptide from Puffer Fish Skin

GUO Hong-hui1，WANG An2，HONG Zhuan1，*
（1.Engineering Research Center of Marine Biological Resource Comprehensive Utilization，Third Institute of Oceanography，State Oceanic Administration，Xiamen 361005，Fujian，China；2.School of Public Health，Central South University，Changsha 410083，Hunan，China）

Abstract：Collagen oligopeptide from puffer fish skin was prepared by two-step enzymatic hydrolysis.The molecular weight of prepared collagen oligopeptide ranged from 100 u to 1000 u.According to the request of “procedures for toxicological assessment of food”and“Chemical irritation，allergic and haemolytic technology guidelines for research”，animal test was utilized for the safety evaluation of collagen oligopeptide from puffer fish skin.Acute oral toxicity test and acute dermal toxicity test indicated that its LD50on SD rats exceeded 5 000 mg/kg and 2 000 mg/kg，respectively.Skin，eye irritation tests were conducted on healthy white rabbits. The mean index of skin irritation and eye irritation（I.A.O.I）on rabbits were 0.The mean index of eye irritation after 48 h was 5.Guinea pigs were used in dermal allergy reaction.The intensity of sensitization wasⅠ.

Key words：puffer；collagen oligopeptide；acute toxicity test；toxicology；safety evaluation