大果沙棘总黄酮体外抗氧化和抑菌作用研究

焦岩，常影，余世锋，孙晓宏，宋春丽（1.齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江齐齐哈尔161006；2.齐齐哈尔大学农产品加工黑龙江省普通高校重点实验室，黑龙江齐齐哈尔161006）

大果沙棘总黄酮体外抗氧化和抑菌作用研究

焦岩，常影，余世锋，孙晓宏，宋春丽
（1.齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江齐齐哈尔161006；2.齐齐哈尔大学农产品加工黑龙江省普通高校重点实验室，黑龙江齐齐哈尔161006）

摘要：研究大果沙棘总黄酮的体外抗氧化和抑菌活性。采用DPPH和ABTS自由基清除率检测大果沙棘总黄酮体外抗氧化活性；通过测定抑菌圈直径和最低抑菌浓度检测大果沙棘总黄酮的抑菌作用。100μg/mL的大果沙棘总黄酮对DPPH和ABTS自由基的清除率分别为65.1%和92.3%，接近芦丁和儿茶素对照品；抑菌试验结果显示：0.125mg/mL～1.0mg/mL的大果沙棘总黄酮对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌有显著的抑菌效果。

关键词：大果沙棘总黄酮；抗氧化；抑菌活性

人体新陈代谢以及体内外环境包括呼吸（氧化反应）、外界污染、放射线照射等因素不断的在人体体内产生自由基。近年来，随着对自由基研究的深入，人体中的活性氧和自由基被认为是引发衰老、癌变和细胞损伤的主要原因。因此，减少自由基对机体的伤害可以减少多种疾病的发生[1]。天然植物中含有多种活性成分，与合成药物相比，天然活性成分相对安全、副作用小。近年来研究表明，植物多酚、黄酮、多糖、甾醇、生物碱等活性成分都有抗氧化和抑菌作用[2]。

沙棘（Hippophaerhamnoides L.）为胡颓子科（Elaeagnaceae）酸刺属植物。沙棘中含有丰富的黄酮类物质，果实中黄酮含量为309mg/100 g～945mg/100 g。研究表明，沙棘总黄酮类具有具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌抗病毒、增强人体的耐受性、降血脂等多种作用[3-5]。因此，在本研究中，通过考察大果沙棘总黄酮的体外抗氧化和抑菌作用，为开发和利用天然黄酮类功能食品和抗菌瘤药物提供理论参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

大果沙棘果渣：黑龙江省孙吴县林业局提供。

菌种：大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）：黑龙江省微生物研究所。

试剂：芦丁、儿茶素标准品、DPPH（1，1-dipheny1-2-picrylhydra-zyl）、ABTS[2，2'-amino-di（2-ethylbenzothiazoline sulphonic acid-6）ammonium salt]：美国Sigma公司；牛肉膏、蛋白胨：国药集团化学试剂有限公司；氯化钠、琼脂、无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝等试剂均为国产分析纯。

1.2仪器与设备

756PC型紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；PHS-25数显pH计：上海精密科学仪器有限公司；培养箱：Thermo Forma公司；显微镜：Nikon公司；SWCJ-IF超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；TDL-5台式离心机：上海安亭科学仪器厂。

1.3方法

1.3.1大果沙棘果渣总黄酮提取纯化

首先用超临界CO2萃取设备将大果沙棘果渣脱脂。然后用75%的乙醇做溶剂，将脱脂后的大果沙棘果渣粉以10∶1（mL/g）液固比进行3次超声波辅助提取，将提取得到的黄酮液经离心、过滤、浓缩、除去乙醇得到大果沙棘果渣黄酮溶液[6]。将黄酮溶液用X-5大孔树脂层析柱进行纯化[7]，纯化后真空冻干得橙黄色固体粉末，采用NaNO2-Al（NO3）3比色法[8]进行测定。经测定分离前后大果沙棘总黄酮纯度分别为11.9%和34.1%。使用前配置成一定浓度的黄酮溶液进行体外抗氧化和抑菌试验。

1.3.2大果沙棘总黄酮对DPPH·自由基清除效果[9]

DPPH溶液配制：准确称取20mgDPPH，用无水乙醇溶解并定容至250mL。

分别吸取10mg/mL～100mg/mL的纯化前后的大果沙棘总黄酮溶液和芦丁、儿茶素标准品溶液2.0mL于具塞试管中（分2组），向其中一组加入DPPH溶液至2mL，摇匀30min后，用无水乙醇做参比在517 nm波长下测吸光度，即为Ai；同时测定2mLDPPH溶液与2m L无水乙醇混合后的吸光度，即为Ac；向另一组中加入无水乙醇至2mL，混合后测其吸光度，即为Aj。根据下式计算清除率K：K/%=（1-（Ai-Aj）/Ac）×100。

1.3.3大果沙棘总黄酮清除ABTS+自由基的活力测定[10]

将5m L的7mmol/LABTS和88μL的140mmol/L过硫酸钾混合，在室温、避光的条件下静置过夜，形成ABTS+自由基储备液。该储备液在室温、避光的条件下稳定。使用前用无水乙醇稀释成工作液，要求其在30℃、734 nm波长下的吸光度为0.7±0.02。

取100μL不同浓度的大果沙棘总黄酮及对照品溶液，加入2mLABTS+溶液，准确振荡30 s，在20℃下测定反应液在734 nm处6min内的吸光值变化。

抑制率/%=A0-（At-B）/A0×100（t=6min）其中，A0为未加样品的ABTS+的吸光值；At为样品与ABTS+反应后的吸光值；B为样品空白的吸光值。

1.3.4大果沙棘总黄酮的抑菌活性

1.3.4.1菌悬液的制备

在无菌环境下，将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌接种于培养琼脂斜面，37℃培养24 h，然后置于10mL 0.9%的生理盐水的试管中，振荡摇匀，1/10系列稀释至含菌量为106CFU/mL～108CFU/mL的菌悬液。

1.3.4.2滤纸片法测定大果沙棘总黄酮的抑菌作用

将定性滤纸用打孔器制成直径为9 mm的小圆片，高压灭菌后，分别浸入沙棘总黄酮、无菌水中30min。用无菌移液管吸取0.2mL菌悬液，加入到制备好的固体平板培养基中，用刮铲将菌悬液涂匀。用无菌镊子镊取含有黄酮的滤纸片平铺在培养基表面上，每皿呈十字铺4片，每个浓度重复3次。并且用浸有无菌水的滤纸片作为空白对照。贴好滤纸片后的平板置于恒温培养箱中培养，即37℃培养24 h，测定其抑菌圈直径，取其平均值[11]。

1.3.5大果沙棘总黄酮的最低抑菌浓度（MIC）的测定

在无菌操作条件下，分别将含有浓度为0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、2.5、3.0mg/mL的沙棘总黄酮的牛肉膏蛋白胨培养基平板中加入0.2m L菌悬液，涂布均匀，以无菌水为空白对照，在相应条件下，即置于37℃恒温培养箱中培养24 h，观察结果，每个浓度做平行试验3次。以不长菌的最低浓度作为该黄酮的最低抑菌浓度（MIC）[12]。

2　结果

2.1大果沙棘总黄酮对DPPH·自由基清除效果

大果沙棘总黄酮对DPPH·自由基清除效果见图1和表1。

图1　清除DPPH·自由基能力的测定Fig.1　Themensuration ofDPPH·free radical-scavenging activity

表1大果沙棘总黄酮清除DPPH·自由基的IC50Table 1　IC50valuesof DPPH·free radical-scavenging activity

由图1可知看出，在浓度为20μg/mL～100μg/mL时，大沙棘总黄酮显示出较好的清除DPPH·自由基能力，100μg/mL时，纯化前后黄酮对DPPH·自由基的清除率分别为49.7%和65.1%，IC50值分别为81.13μg/mL 和64.4μg/mL。在相同浓度条件下，纯化后黄酮对DPPH·自由基的清除率比粗提物高，但比芦丁和儿茶素都低，儿茶素最高。

2.2大果沙棘总黄酮对ABTS+自由基的除效果

大果沙棘总黄酮对ABTS+自由基清除效果见图2和表2。

图2　不同样品对ABTS+自由基清除力的比较Fig.2　Themensuration of ABTS+free radical-scavenging activity

表2　大果沙棘总黄酮清除ABTS+自由基的IC50Table 2　IC50valuesof ABTS+free radical-scavenging activity

当浓度在20μg/mL～60μg/mL范围时，随着质量浓度的增加，4种样品清除ABTS+自由基清除能力明显提高，ABTS+自由基清除能力大小为儿茶素对照＞卢丁＞纯化黄酮＞粗提黄酮。但是当浓度大于60μg/mL时，纯化黄酮的ABTS+自由基清除能力略大于芦丁，但始终小于儿茶素。ABTS+的清除能力大小依次为儿茶素＞芦丁＞纯化后黄酮＞粗黄酮，100μg/mL时，纯化前后黄酮对ABTS+自由基的清除率分别为80.1%和92.3%，IC50值分别为42.45μg/mL和30.76μg/mL。

2.3大果沙棘总黄酮的抑菌结果

2.3.1大果沙棘总黄酮的抑菌活性

大果沙棘总黄酮的抑菌活性见表3。

表3　大果沙棘总黄酮对试验菌的抑制效果Table 3　Bacteria inhibition zoneof different concentration of flavonoids

由表3可知不同浓度的大果沙棘总黄酮对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌均有不同程度的抑菌效果，抑菌圈直径分别为：14.38、13.25、12.75mm。由此可见，大果沙棘黄酮具有显著的抑菌活性，对不同菌种抑制作用大小依次为：大肠杆菌＞枯草芽孢杆菌＞金黄色葡萄球菌。

2.3.2大果沙棘总黄酮的最低抑菌浓度（MIC）的测定结果

不同浓度大果沙棘总黄酮的抑菌结果见表4。

表4　不同浓度大果沙棘总黄酮对试验菌的最低抑菌浓度Table4　M inimum inhibitory concentration（M IC）of flavonoids

最低抑菌浓度（MIC）是测量抗菌药物的抗菌活性指标，指在体外培养18 h～24 h后能抑制培养基内病原菌生长的最低药物浓度。由表4可以得出结论，大肠杆菌的最低抑菌浓度为0.5mg/mL；枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度为1.0mg/mL；金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为1.0mg/mL。

3　结论

1）抗氧化研究表明，100μg/m L的大果沙棘总黄酮对DPPH·自由基的清除率分别为49.7%和65.1%，IC50值分别为81.13μg/mL和64.4μg/mL；对ABTS+自由基的清除率分别为80.1%和92.3%，IC50值分别为42.45μg/mL和30.76μg/mL。其抗氧化能力接近芦丁和儿茶素对照品。说明大果沙棘总黄酮的纯度和其抗氧化活性存在着显著的量效关系，通过和黄酮类标准品对比也进一步证实了大果沙棘总黄酮的体外抗氧化作用。

2）通过抑菌试验，得出大果沙棘总黄酮对3种常见危害菌大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制效果，抑菌效果大小依次为大肠杆菌>枯草芽孢杆菌>金黄色葡萄球菌。

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DO I：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.19.004

收稿日期：2014-03-14

基金项目：黑龙江省教育厅项目（12521593）

作者简介：焦岩（1981—），男（汉），副教授，博士，研究方向：生物活性物质与功能食品。

Study on the An tioxidant and Antibacterial Activities in Vitro of Seabuck thorn Flavonoids

JIAOYan，CHANGYing，YUShi-feng，SUNXiao-hong，SONGChun-li
（1.College of Food and Biological Engineering，Qiqihar University，Qiqihar161006，Heilongjiang，China；2.Key LaboratoryofProcessing Agricultural ProductsofHeilongjiang Province，Qiqihar University，Qiqihar 161006，Heilongjiang，China）

Abstract：The study was purported to research on the antioxidant activities in vitro and antibacterial activities ofseabuckthorn flavonoids.The capacitiesof eliminating 1，1-dipheny1-2-picrylhydra-zyl（DPPH·）and the 2，2'-amino-di（2-ethyl-benzothiazoline sulphonic acid-6）ammonium salt（ABTS+）were assayed compared with the standard sample of rutin and catechin controls.The antibacterial activities were studied through the detemination of the antibacterial circle diameter and minimum inhibitory concentration.The seabuckthorn flavonoids in 100μg/mL had a capacitiesof eliminating DPPH·and ABTS+at the percentages of 65.1%and 92.3%，respectively，approximate to the rutin and catechin at the same concentration and the antibacterial studies showed strong antibacterialeffectagainst Escherichia coli，Staphylococcusaureus and Bacillus subtilis.

Keywords：seabuckthorn flavonoids；antioxidation；antibacterial