中华鳖粉中氨基脲来源及相关性分析

曹爱玲，沈立，蔡路昀，张建人（.萧山出入境检验检疫局，浙江杭州208；2.渤海大学食品科学与工程学院，辽宁省食品安全重点实验室，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，辽宁锦州20；.杭州萧山天福生物科技有限公司，浙江杭州208）

中华鳖粉中氨基脲来源及相关性分析

曹爱玲1，沈立1，蔡路昀2，*，张建人3
（1.萧山出入境检验检疫局，浙江杭州311208；2.渤海大学食品科学与工程学院，辽宁省食品安全重点实验室，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，辽宁锦州121013；3.杭州萧山天福生物科技有限公司，浙江杭州311208）

摘要：研究不同处理条件下中华鳖粉中氨基脲（SEM）残留呈阳性的原因。研究从养殖环节、加工环节全链条分析氨基脲的可能来源。结果表明，养殖环节使用消毒剂与SEM呈阳性无关。高温烘干会导致氨基脲呈阳性，且随着烘干温度的升高，氨基脲检出值也随之升高。中华鳖不同部位组织的氨基脲生成量存在着明显差异，总体上鳖肉的SEM生成量高于鳖骨，但130℃高温烘干时鳖骨的SEM含量要高于鳖肉；进一步的蛋白质分析表明，氨基脲的产生和样品的蛋白质含量和组成密切相关。

关键词：中华鳖；氨基脲；消毒剂；蛋白质

氨基脲（Semicarbazide，SEM）是呋喃西林的代谢产物，其与蛋白紧密结合，形成稳定的残留物质。氨基脲结构简单，来源广泛，在食品生产加工过程中都可以产生[1-2]。目前已有文献报道的食品中氨基脲的来源主要有兽药呋喃西林的代谢物[3]、以偶氮二甲酰胺为发泡剂制作的食品接触材料[4]、以及在食品车间和农业上使用次氯酸盐进行卫生处理和消毒产生的氨基脲[5]等。我国是水产大国，每年有大量的水生动物源性产品出口，天然海捕水产品中曾检出了氨基脲，如海捕虾仁中检出氨基脲，这显然不能用呋喃西林的代谢物来解释其来源。有研究认为，甲壳类水产品中含氨基脲极有可能就是动物自身产生的，并不是违规用药的结果[2]。

中华鳖（Pelodiscus sinensis）属龟鳖目（Testudinata）鳖科（Trionychidae）鳖属（Trionyx），俗称甲鱼。我国是中华鳖的养殖和出口大国，由于活体中华鳖存在销售周期短、产品风险高、附加值低等不利因素影响，国内企业正在向着中华鳖深加工产品-中华鳖粉方向发展，这既可出口创汇，又可减轻鲜活中华鳖面对市场的销售压力，促进中华鳖养殖业的可持续发展。然而在原料最终加工成中华鳖粉后却出现了呋喃西林代谢物氨基脲残留呈阳性现象，严重困扰和制约中华鳖粉产业发展。因此研究中华鳖粉加工过程中氨基脲生成量的差异及其相关性分析，对于有效控制氨基脲的产生，维护消费者健康以及保护我国出口贸易具有重要意义。本研究从中华鳖养殖环节、到加工环节，全程跟踪分析，考查了不同养殖条件、不同加工条件下中华鳖组织样品氨基脲生成量的差异，查找呋喃西林代谢物检出阳性的原因，为中华鳖粉生产过程中氨基脲的控制提供理论参考。

1　材料和方法

1.1仪器与试剂

Alpha 1-4 LSC型冷冻干燥机：德国Christ公司；DGX-9143B-1型电热循环烘箱：上海福玛实验设备公司；DJ-04BDJ-04型不锈钢粉碎机：上海淀久中药机械制造有限公司；Revco ULT-1786型超低温冰箱：美国Thermo公司；Xevo TQ-S型液质联用仪：美国Waters公司；Kjeltec 8400凯氏定氮仪：瑞典Foss公司；Milli-Q超纯水系统，美国Millipore公司；呋喃西林（纯度≥99%）：Sigma公司；氨基脲盐酸盐和氨基脲同位素标准品（纯度≥99%）：德国Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、乙酸乙酯、乙腈等都为色谱纯；其余化学试剂都为分析纯。

1.2方法

本试验从养殖和加工2个环节分析SEM阳性的可能来源。在养殖环节，用阳性药物添加组作为对照，同时再另设2个试验组，分别是消毒剂处理组和非消毒剂处理组，用于研究消毒剂是否对SEM产出造成影响。在加工环节，将中华鳖分成肉、骨2部分，并设定冻干、100、130℃3种条件下制成中华鳖粉。研究温度及中华鳖自身不同成分对SEM生成的影响。

1.2.1前期准备

试验饲料：本试验期间所用饲料为出口中华鳖养殖场单独加工配制，不添加任何药物（阳性对照组饲料除外），饲料经实验室检测不含呋喃西林；试验用水：本试验期间所用养殖及加工用水均为自来水，经实验室检测不含呋喃西林，排除地下水等可能的环境污染；试验中华鳖：本试验中华鳖由温室养殖至400 g左右，整个养殖过程避免接触呋喃西林药物，进入试验池前，活体中华鳖经检测不含SEM。以上试验饲料、水和中华鳖呋喃西林原药及SEM检测结果见表1。

表1 本试验各阶段过程中呋喃西林原药及SEM检出量Table 1　Nitrofurazoneand SEM amountsin differentperiods μg/kg

1.2. 2试验过程

将中华鳖放入准备好的甲、乙、丙3个暂养池中，甲为阳性对照组；乙为非消毒处理组；丙为消毒处理组。每个试验组放40只400 g大小的中华鳖，做好日常水质管理，投喂无药物残留的试验饲料，待驯化正常摄食一周后开始按试验分组设计步骤进行研究试验。

给甲组配制含有一定浓度的呋喃西林药饵（2g/kg，10%有效含量），每天按中华鳖体重的1.5%～2.0%作为投喂量投喂药饵，连续喂养3个月。乙组投喂不含药物的试验饲料，并且采取不施加任何消毒剂，连续喂养3个月，丙组投喂不含药物的试验饲料，并且采取正常消毒，连续喂养3个月。

1.3样品检测

3个月饲喂期结束后，将以上3组试验中华鳖清洗-宰杀-分割成肉、骨头，并分别冻干、100℃烘干和130℃烘干。将上述冻干、烘干的中华鳖肉、骨用粉碎机进行磨粉，按80目标准进行过筛，未过筛的重复再打磨一次。

1.3.1SEM的测定

样品中SEM分析参考检测方法[6-7]，具体如下，称取2 g样品，加入10mL甲醇溶液（1∶1，体积比），振荡后4000 r/min离心5min，去上清。往残留物中加入10mL，0.2mol/L盐酸，10 000 r/min均质1min，依次加入内标工作液100μL，邻硝基苯甲醛溶液100μL，混合30 s后振荡30min，37℃恒温箱衍生16 h。然后加入适量Na2HPO4溶液混匀后，调pH至7.4，加入10m L乙酸乙酯，振荡10min后，10 000 r/min离心10min，收集上清液，重复提取一次，合并收集液，氮气吹干后，残渣用1mL 5%乙酸铵甲醇溶液溶解，再加入2mL正己烷，去除上层溶液后过0.22μm滤膜，取10μL供检测。

色谱条件 色谱柱：ACQUITY BEH C18，2.1 mm× 100mm，1.7μm，美国Waters公司；流动相A（乙腈），流动相B（0.1%甲酸溶液）；梯度洗脱0～7min，10%A-90%A；7min～10min，90%A；10min～10.01min，90% A～10%A；10.01min～20min，10%A；流速：200μL/min，柱温：30℃。

质谱条件：离子源为ESI，扫描方式为正离子扫描，检测方式为MRM，定性离子对为209/192、209/ 166，定量离子对为209/166，驻留时间0.5 s，锥孔电压25V，碰撞能量8 eV。

1.3.2蛋白质的测定

称取2 g样品与硫酸、催化剂等共同加热消化，采用凯氏定氮法测定[8]。

1.3.3数据分析

采用SAS软件进行分析，部分结果用平均值±标准方差表示。

2　结果与讨论

2.1不同处理条件下的SEM生成量差异

采用内标法对不同处理条件下的样品进行SEM定量检测，结果如表2所示。

表2不同处理组的SEM残留检测Table 2　SEM amountof sam p lesunder differen t treatments μg/kg

呋喃西林代谢物SEM来源极为复杂，目前已经在不同的食品中发现了SEM，而且来源各异，除了使用呋喃西林药物导致的代谢物残留之外，食品包装、面粉改良剂及食品加工程序都可成为食品中SEM污染的来源[9]。本研究在排除外界人为添加呋喃西林药物的情况下，仍在中华鳖粉中检出了SEM，且SEM在肉、骨中的分布与人为添加呋喃西林药物的残留分布不一致，表明自然状态下，中华鳖粉中SEM的存在与外界呋喃西林药物污染无关。

有研究表明，食品加工过程中，经次氯酸盐处理后，会检测到氨基脲SEM[5，10]。中华鳖粉在后续加工过程中均未接触消毒剂，唯独在养殖过程中会对水体定期使用消毒剂进行日常杀菌消毒。本试验结果显示，不使用消毒剂组的鳖粉中也检出了SEM，说明养殖中使用消毒剂与SEM检出无直接关系。

根据本试验，中华鳖粉中呋喃西林代谢物的来源与干燥工艺有关，且与烘干温度呈正相关。100℃烘干温度下处理的中华鳖，其呋喃西林代谢物检出为微量的1μg/kg～2μg/kg。据此推测，该温度可能是中华鳖粉原料在高温下发生化学变化产生呋喃西林代谢物的临界温度。而随着温度的升高，呋喃西林代谢物形成也逐渐增多。高温处理下，骨粉中呋喃西林代谢物的形成明显高于肉粉，这可能与骨、肉在蛋白质含量及氨基酸组成上的差异密切相关。

2.2蛋白质含量检测及其与SEM生成量相关性分析氨基脲为联氨类化合物，其来源与样品中的含氮物质密切相关。为了进一步探究氨基脲的产生来源，用凯氏定氮法对中华鳖肉和鳖骨样品中的蛋白质含量进行测定，重复3次取其平均值，结果如表3所示。

表3　不同处理条件下的中华鳖肉和鳖骨的蛋白含量（n=3）Table3　Protein content ofm eatand boneof turtleunder different treatments（n=3）%

从表3中得知，用不同的干燥条件处理样品，氨基脲生成量在鳖肉中的含量要高于鳖骨（除130℃烘干条件外），而表3上鳖肉的蛋白质含量要显著高于鳖骨，这表明一般情况下氨基脲生成量与样品中的蛋白质含量存在着很高的关联性，蛋白质含量高的鳖肉比其他蛋白含量低的鳖组织更容易产生氨基脲。但对于130℃烘干条件下，鳖骨中产生了比鳖肉中更高的氨基脲生成量，这也证明了氨基脲的生成不仅跟样品中蛋白质含量有关，还可能与样品中的其他组分，比如氨基酸组成有关联，谢冬冬等[5]研究发现，被处理的动物组织中的氨基脲含量随着不同部位中蛋白质及氨基酸含量的上升而随之增加，蛋白质含量越多，氨基脲的含量越高，其中精氨酸含量的差异是导致氨基脲生成量差异的主要原因。

3　结论

外源添加呋喃西林药物后，制成的中华鳖粉中SEM主要残留在肉中，肉中残留浓度是骨中的3倍，而非外源添加药物造成的SEM残留在肉、骨中含量基本均衡，差异不显著。

中华鳖在整个养殖加工过程中仅养殖环节会使用消毒剂，而本试验结果显示养殖过程中使用消毒剂组与不使用消毒剂组均微量检出SEM，由此推论中华

鳖养殖过程使用消毒剂，与中华鳖粉中SEM的检出无直接关系。

冻干处理的中华鳖粉中呋喃西林代谢物检测呈阴性，而烘干处理的呋喃西林代谢物检测呈现阳性，且呋喃西林代谢物检测浓度随着烘干温度的升高而升高。此外，在130℃高温处理下，骨粉中呋喃西林代谢物的形成明显高于肉粉，这可能与其氨基酸组成差异有关。

参考文献：

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[6]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 21311-2007动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法高效液相色谱1串联质谱法 [S].北京:中国标准出版社,2007:1-10

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DO I：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.19.001

收稿日期：2014-04-14

基金项目：浙江检验检疫局科研项目（ZK201151）；国家自然科学基金（31401478）；“十二五”国家科技支撑计划（2012BAD29B06）

作者简介：曹爱玲（1981—），女（汉），兽医师，硕士，主要研究动物兽药残留。

*通信作者

Correlative Analysis on the Occurrence of Sem icarbazide of Pelodiscus Sinensis

CAOAi-ling1，SHENLi1，CAILu-yun2，*，ZHANG Jian-ren3
（1.Xiaoshan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Hangzhou 311208，Zhejiang，China；2.College of Food Scienceand Technology，BohaiUniversity；Food Safety Key Lab of Liaoning Province；National&Local JointEngineering Research Centerof Storage，Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products，Jinzhou 121013，Liaoning，China；3.Hangzhou Xiaoshan Tianfu Bio-tech Co.，LTD，Hangzhou 311208，Zhejiang，China）

Abstract：This paper studied the reason of remains psitire in Pelodiscus Sinensis powder under different treatments.The possible source of SEM was investigated from breeding to processing throughout thewhole chain. The results indicated that the use of disinfectantswas irrelevantwith SEM positive，while high temperature of drying wowld cause SEM positive.The amount of SEM was higher as the drying temperature was higher.The amount of semicarbazide was distinctly different between different tissues，and meatwas higher than bone，except for 130℃drying treatment.Further analysis showed that semicarbazide generation was closely related with protein contentand their composition.

Key words：Pelodiscus sinensis；semicarbazide；disinfectant；protein