虎皮香菇漆酶的发酵优化

孙瑞雪，杨萍，刘琦，李晓辉，姜文侠，*（1.天津科技大学，天津300457；.中国科学院天津工业生物技术研究所，天津市工业生物系统与过程工程重点实验室中国科学院系统微生物工程重点实验室，天津300308）

虎皮香菇漆酶的发酵优化

孙瑞雪1，2，杨萍2，刘琦2，李晓辉1，2，姜文侠2，*
（1.天津科技大学，天津300457；2.中国科学院天津工业生物技术研究所，天津市工业生物系统与过程工程重点实验室中国科学院系统微生物工程重点实验室，天津300308）

摘要：为制备食品级漆酶，以可用于食品的原料对虎皮香菇的漆酶发酵进行优化，考察培养条件、碳源、氮源及铜离子等因素对发酵产酶的影响。确定虎皮香菇产漆酶的发酵培养基为：果糖48 g/L，玉米粉12g/L，胰蛋白胨9g/L，NH4H2PO41 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，CuSO4·5H2O 1mmol/L；培养温度为30℃，初始pH自然，种龄3 d，接种量6%（体积比），装液量150mL/500mL三角瓶，发酵1 d～4 d摇床转速为150 r/min，第4 d～11 d摇床转速为200 r/min，发酵液中漆酶活性达到462.59 U/mL，为优化前的26倍。

关键词：虎皮香菇；漆酶；发酵优化

漆酶可以催化酚类、芳胺、羧酸、金属有机化合物以及一些甾类激素和生物色素等超过250种底物。由于漆酶特殊的催化性能和广泛的作用底物，漆酶在木质素降解、食品除氧、果汁澄清、纸浆漂白、麻类脱胶、有机合成以及环境污染物的降解等方面有着广阔的应用前景，成为绿色催化研究的热点[1-3]。

虎皮香菇（Lentinus tigrinus），属伞菌目，侧耳科，香菇属，生于阔叶树腐木上，是一种食用真菌，易于进

1　材料与方法

1.1菌种

虎皮香菇（Lentinus tigrinus）TIB.BPE 11072，中国科学院天津工业生物技术研究所发酵过程研究组保藏。

1.2主要试剂与仪器

玉米粉：梅河口市兴达米业有限责任公司；发酵专用豆粕粉2980、发酵专用豆饼粉2950：北京中棉紫光生物科技有限公司；中温黄豆饼粉、低温黄豆饼粉、低温粕、高温粕：山东万得福实业集团有限公司；α-淀粉酶：北京索莱宝科技有限公司；果糖：河北华旭制药有限责任公司；胰蛋白胨：北京双旋微生物培养基制品厂；2，2'-连氮-双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸钠）：Sigma；紫外可见分光光度计（TU-1810型）：北京普析通用仪器有限责任公司；恒温振荡器：美国精骐有限公司；pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；低温恒温循环器（ILB-008-01型）：施都凯仪器设备（上海）有限公司。

1.3培养基

斜面培养基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉2 g/L，琼脂15 g/L，以花生壳浸出液配制。

花生壳浸出液：粉碎的花生外壳100g，自来水1L，煮沸30min，过滤得滤液。

种子培养基：玉米粉30 g/L、豆粕粉15 g/L、α-淀粉酶54U/L、KH2PO43 g/L、MgSO4·7H2O 1.5 g/L。

发酵基础培养基：可溶性淀粉20 g/L，蛋白胨10 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，CuSO4· 5H2O 0.04mmol/L，121℃灭菌20min。

1.4漆酶发酵条件的优化

1.4.1碳源和氮源对漆酶发酵的影响

分别以不同的碳源和氮源代替发酵基础培养基中的可溶性淀粉和蛋白胨，30℃摇床150 r/min培养11d。

1.4.2铜离子浓度对漆酶发酵的影响

在经过碳源和氮源优化的发酵培养基中添加CuSO4·5H2O使其终浓度为0～3 mmol/L，30℃摇床150 r/min培养11 d。

1.4.3培养条件对漆酶发酵的影响

以优化的培养基，分别考察培养温度（25℃～35℃）、培养基初始pH（3.0～7.0）、装液量（100 mL/500 mL～250mL/500mL三角瓶）、接种量（2%～14%）、菌种种龄（2 d～5 d）及摇床转速（150 r/min～350 r/min）对漆酶发酵的影响。

1.5漆酶活性的定义和测定方法

一个酶活单位（U）的定义是：在下述测定条件下，每分钟催化1μmol ABTS所需的酶量。酶活计算公式为：

式中：U为酶活，U/mL；V为反应总体积，mL；ΔOD 为420 nm吸光度的变化；n为酶液的稀释倍数；ε420= 36 000M-1cm-1为氧化型ABTS的摩尔吸光系数；v为酶液体积，mL；t为反应时间，min；L为比色皿的光径，cm。

参考文献[4]方法：控制分光光度计样品池温度为漆酶的最适反应温度40℃，反应体系为3mL，向光径为1 cm的比色皿中加入2.7m L浓度为0.05mol/L的柠檬酸钠缓冲液（pH 4.6）和0.2mL浓度为0.5mmol/L 的ABTS，混匀，再加入0.1mL稀释至适宜倍数的酶液，混匀后迅速放入样品池，测定最初反应3min内反应液在420 nm处吸光度的变化。以加热煮沸5min的酶液作对照。

1.6生物量的测定

以菌丝体干重表示[5]，发酵液经离心、洗涤后收集菌丝体，置105℃烘箱中干燥至恒重。

2　结果与讨论

2.1虎皮香菇的生长曲线和产酶曲线

采用发酵基础培养基，测定虎皮香菇生长曲线和产酶曲线，结果见图1。

图1　虎皮香菇的生长曲线与产酶曲线Fig.1　Changesofbiomassand laccaseactivity during fermentation

如图1所示，生物量在第1 d～4 d迅速增加，几乎看不到延迟期，第4 d～10 d菌丝体生物量基本恒定，处于生长稳定期，此后生物量逐渐下降。发酵的第2 d酶活迅速增加，至发酵11 d开始进入衰亡期酶活达到最高。因此将虎皮香菇的漆酶发酵周期定为11 d。

2.2碳源对漆酶发酵的影响

2.2.1碳源种类对漆酶发酵的影响

以不同的碳源取代发酵基础培养基中相同质量的可溶性淀粉，其他条件不变，筛选适合的碳源，结果见图2。

如图2所示，碳源对漆酶发酵的影响很大，以葡萄糖为碳源时发酵液的酶活最高，达到28.83U/mL，其次为麦芽糖和果糖。

2.2.2碳源浓度对漆酶发酵的影响

分别以浓度为20 g/L～100 g/L的葡萄糖、麦芽糖和果糖为碳源，考察碳源浓度对漆酶发酵的影响，结果见图3。

图2 碳源种类对漆酶发酵的影响Fig.2　Effectof carbon sourceson laccase ferm entation

图3 碳源浓度对漆酶发酵的影响Fig.3　Effectof carbon sourcesconcentration on laccase ferm en tation

如图3所示，提高碳源浓度后，以果糖为碳源时发酵液中漆酶酶活明显提高，且优于同浓度的葡萄糖和麦芽糖，在果糖浓度60 g/L时发酵酶活达到最大值73.6U/mL。根据此结果选用浓度为60 g/L的果糖为漆酶发酵的碳源。

2.2.3复合碳源对漆酶发酵的影响

单糖利于微生物的利用，但不利于漆酶的分泌；多糖难以被直接利用，影响菌体生长，但它有利于漆酶的合成[6]。担子菌有利用多糖的能力，因此，将碳源总浓度定为60 g/L，以玉米粉和果糖按不同的质量比作碳源，考察复合碳源对发酵产酶的影响，结果见图4。

图4　果糖和玉米粉不同的质量比对漆酶发酵的影响Fig.4　Effectof com posite carbon source on laccase fermentation

如图4所示，选用复合碳源后发酵酶活显著提高，当果糖与玉米粉的质量比为8∶2时酶活最高。我们认为其原因是玉米粉为发酵过程提供了持续的碳源供给。

2.3氮源对漆酶发酵的影响

2.3.1不同有机氮源对漆酶发酵的影响

以20 g/L的葡糖糖为碳源，用不同的有机氮源取代发酵基础培养基中相同质量的蛋白胨，考察有机氮源种类对漆酶发酵的影响，结果见图5。

图5　有机氮源种类对漆酶发酵的影响Fig.5　Effectof organic nitrogen sourceon laccase fermentation

如图5所示，有机氮源对漆酶发酵影响非常显著，以蛋白胨为氮源时发酵液中漆酶酶活最高（30.84U/mL），其次是胰蛋白胨。

2.3.2有机氮源浓度对漆酶发酵的影响

以60 g/L的葡糖糖为碳源，分别用浓度为5 g/L～60 g/L的蛋白胨和胰蛋白胨为氮源，考察有机氮源浓度对漆酶发酵的影响，结果见图6。

图6　有机氮源浓度对漆酶发酵的影响Fig.6　Effect of organic nitrogen sou rce concen tration on laccase ferm en tation

如图6所示，相同浓度下，胰蛋白胨优于蛋白胨，两种氮源浓度均在10%时酶活最高，故选用10 g/L的胰蛋白胨作为漆酶发酵的有机氮源。

2.3.3无机氮源对漆酶发酵的影响

单独使用无机氮为氮源时，虎皮香菇菌丝体生物量较少，酶活较低，因此，在以胰蛋白胨为有机氮源的基础上添加无机氮，考察添加无机氮对漆酶发酵的影响。胰蛋白胨与无机氮按8∶2的质量比添加，结果见图7。

图7 无机氮对漆酶发酵的影响Fig.7　Effect of inorganic nitrogen source on laccase ferm entation

如图7所示，当以磷酸二氢铵为无机氮源时酶活较高，其次是硫酸铵，故选用磷酸二氢铵作为漆酶生产的无机氮源。

2.3.4复合氮源对漆酶发酵的影响

为考察有机氮源和无机氮源对虎皮香菇发酵漆酶的协同作用，将氮源总浓度定为10 g/L，胰蛋白胨和磷酸二氢铵按不同的质量比作复合氮源，结果见图8。

图8 复合氮源对漆酶发酵的影响Fig.8　Effectof com positenitrogen source on laccase fermentation

如图8所示，当胰蛋白胨和磷酸二氢铵的质量比为9∶1时，发酵酶活最高，是使用单一氮源的1.17倍。

2.4培养基中Cu2+浓度对漆酶发酵的影响

漆酶分子中含有铜离子，因此考察铜离子浓度对发酵的影响。在碳氮源优化后的发酵培养基中添加CuSO4·5H2O，使其在培养基中的浓度为0～3mmol/L，结果见图9。

图9　铜离子浓度对漆酶发酵的影响Fig.9　Effectof copper ion concentration on laccase fermentation

如图9所示，培养基中不添加Cu2+时发酵酶活仅为0.54U/mL，但铜离子浓度过高也会对菌株有毒害作用，不利于产酶，当Cu2+浓度为1mmol/L时，发酵液中漆酶的酶活最高，达到321.04U/mL。

2.5Cu2+的添加时间对漆酶发酵的影响

考察Cu2+添加时间对产酶的影响，结果见图10。

图10　铜离子添加时间对漆酶生产的影响Fig.10　Effect of copper ion concentration on laccase ferm entation

如图10所示，Cu2+的添加时间对发酵液中漆酶酶活有较大影响，且Cu2+添加时间与发酵液中漆酶的酶活基本呈负相关，故在发酵接种前添加Cu2+。

2.6培养温度对漆酶发酵的影响

在上述培养基优化的基础上，采用不同的发酵温度，其他条件不变，考察发酵温度对漆酶发酵的影响，结果见图11。

图11　温度对漆酶生产的影响Fig.11　Effectof the incubation tem peratureon laccase fermentation

如图11所示，在30℃～35℃之间，随着温度上升发酵酶活迅速下降；而在25℃～30℃之间，温度对发酵酶活基本无影响；在较低温度下培养时菌丝体生长缓慢，到达生长稳定期的时间增加，使总发酵周期延长，不利漆酶生产，故将发酵过程中培养温度设定在30℃。

2.7培养基初始pH对漆酶发酵的影响

考察培养基的初始pH对漆酶发酵的影响，结果见图12。

如图12所示，在酸性范围内，随着培养基初始pH的增加，发酵液中漆酶酶活逐渐增加，在pH 5.5～6.5时达到最大值（354.73 U/mL），因此采用培养基的自然pH 5.7。

图12 培养基初始pH对漆酶生产的影响Fig.12　Effectof the initialpH on laccase fermentation

2.8摇瓶装液量对漆酶发酵的影响

装液量是影响摇瓶溶氧的指标，考察摇瓶装液量对漆酶发酵的影响，结果见图13。

图13　装液量对漆酶生产的影响Fig.13　Effect of them edium volum eon the laccase ferm entation

如图13所示，500 mL摇瓶装液量为100 mL～250 mL时，随着装液量的增加，漆酶酶活先增加后降低，在500mL三角瓶中装液量为125mL时，发酵酶活达到最大值334.8U/mL。考虑到漆酶发酵周期较长，蒸发量较大，将装液量定为150mL/500mL三角瓶。

2.9接种量对漆酶发酵的影响

接种量在很大程度上影响菌体的生长与产物的合成，将培养好的液体种子按不同的接种量接入发酵培养基，考察接种量对漆酶发酵的影响，结果见图14。

图14　接种量对漆酶生产的影响Fig.14　Effectof the inou lum sizes on the laccase ferm entation

如图14所示，当接种量较少时，发酵液中菌体生物量较少，不利于漆酶生产，随接种量增加，产酶增多；当接种量达到6%后，酶活不再增加，所以接种量选定6%。

2.10种龄对漆酶发酵的影响

将不同种龄的种子液接入发酵培养基中，考察种龄对漆酶发酵的影响，结果见图15。

图15　种龄对漆酶生产的影响Fig.15　Effect of the seed ageon the laccase ferm entation

如图15所示，种龄为3 d～4.5 d时发酵酶活最高，从图1的生长曲线可见，是在对数期的后期，故将种龄确定为3 d。

2.11摇床转速对漆酶发酵的影响

摇床转速影响摇瓶内的溶氧量，从而影响菌体的生长及产酶，考察摇床转速对发酵产酶的影响，结果见图16。

图16　转速对漆酶发酵的影响Fig.16　Effectof the fermentation speed on laccase fermentation

如图16所示，提高摇床转速，发酵液溶氧量增加，当摇床转速为200 r/min时漆酶酶活最高。

2.12摇床变速培养对漆酶发酵的影响

在发酵初期，当转速为200 r/min时，菌丝团聚集，不利于菌体生长及后期产酶，因此在菌体生长对数期，即发酵前4 d将转速降为150 r/min，之后再提高至200 r/min。与200 r/min恒速培养比较，变速培养的发酵酶活为462.59U/mL，是恒速培养的1.3倍。

3　结语

在虎皮香菇漆酶发酵的第1 d～4 d，以菌丝体生长为主，漆酶产生较少，培养的4 d～11 d漆酶大量产生，发酵11 d时漆酶的发酵酶活最高。

优化后的发酵培养基组成为：果糖48 g/L，玉米粉12 g/L，胰蛋白胨9 g/L，NH4H2PO41 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，CuSO4·5H2O 1mmol/L，自然pH。优化后的培养条件为：培养温度为30℃，种龄3 d，接种量为6%，发酵1 d～4 d转速为150 r/min，4 d～11 d转速为200 r/min，装液量为150m L/500m L三角瓶，发酵周期11 d，漆酶发酵活性达到462.59 U/mL，为优化前的26倍。

漆酶研究的历史较长，但在我国还是新兴的酶制剂产品，随着食品级漆酶的国产化，必将推动漆酶在我国食品和饮料工业中的应用。

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DO I：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.21.040

基金项目：天津市科技支撑计划重点项目（13ZCZDSY05400）；中国科学院重点部署项目（KSZD-EW-Z-015）

作者简介：孙瑞雪（1986—），女（汉），研究生，研究方向：发酵工程。*通信作者：姜文侠（1964—），男（汉），研究员，研究方向：发酵工程。行固体栽培和液体发酵培养，具有漆酶产量高，菌丝体和代谢产物可直接应用于食品行业等优势，因此虎皮香菇符合制备食品级漆酶对菌种的食品安全要求。本文以可用于食品的原料优化该菌株的漆酶发酵，提高发酵酶活。

收稿日期：2014-03-26

Ferm entation Optim ization of Laccase by Lentinus tigrinus

SUNRui-xue1，2，YANGPing2，LIUQi2，LIXiao-hui1，2，JIANGWen-xia2，*
（1.Tianjin Universityof Science&Technology，Tianjin 300457，China；2.Tianjin Key Laboratory for IndustrialBiological Systemsand Bioprocessing Engineering，Key Laboratory of SystemsMicrobial Biotechnology，Tianjin Instituteof Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308，China）

Abstract：In thisstudy，for the production of food-grade laccase，the nutritional and environmental conditions of a laccase produce strain，Lentinus tigrinus，were investigated and optimized.The optimum conditions described as follows：fructose 48 g/L，corn flour 12 g/L，tryptone 9 g/L，NH4H2PO41 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，CuSO4·5H2O 1 mmol/L，temperature 30℃，pH natural，inoculum age 3 d，inoculum size 6%，medium volume 150mL/500mL，rotated speed 150 r/min on 1 d-4 d and 200 r/min on 4 d-11 d. With thoseoptimum conditions，the laccaseactivity reached at462.59U/mL increasing by26 timescompared to beforeoptimcizing.

Keywords：Lentinus tigrinus；laccase；fermentation；optimization