Cripto-1在肝癌中的表达及与侵袭转移的关系

戴　帅，李建生，许戈良，荚卫东，马金良，刘文斌

Cripto-1在肝癌中的表达及与侵袭转移的关系

戴帅，李建生，许戈良，荚卫东，马金良，刘文斌

摘要目的检测Cripto-1蛋白在不同转移潜能的人肝癌细胞株、肝癌及相应癌旁组织中的表达水平，探讨Cripto-1蛋白的表达与肝癌侵袭转移能力之间的关系。方法采用Western blot方法检测不同转移潜能的人肝癌细胞株、肝癌及相应癌旁组织中Cripto-1的蛋白表达水平；采用免疫组织化学染色方法检测肝癌组织中Cripto-1蛋白的表达并探讨与临床病理参数之间的关系。结果与癌旁肝组织相比，肝癌组织中Cripto-1的蛋白表达水平明显升高。Cripto-1蛋白在肝癌细胞株中的表达水平与细胞株的侵袭潜能呈正比。与正常肝组织（0%）比较，Cripto-1在肝癌组织（64．6%）中高表达，且与肿瘤分化程度、血管侵犯和转移状态有相关性（P＜0．05）。结论Cripto-1蛋白在肝癌中高表达，并且其表达量与肝癌的侵袭转移能力密切相关。

关键词肝细胞癌；畸胎瘤衍生生长因子；侵袭；转移

2015-06-26接收

李建生，男，教授，主任医师，博士生导师，责任作者，E-mail：lijiansheng1953＠163．com肝癌是常见的消化系统肿瘤，低手术切除率和术后复发转移使其成为病死率最高的恶性肿瘤之一，所以对肝癌侵袭转移方面的研究成为当前肝癌研究的热点［1］。Cripto-1又称畸胎瘤衍生生长因子TDGF-1，属于EGF-CFC基因家族成员，是一种在胚胎干细胞中表达并对其维持自我更新能力至关重要的调控基因。研究［2］显示Cripto-1的表达在多种肿瘤中重新出现，并调控肿瘤的增殖、侵袭、血管生成和内皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）等重要事件。因此，研究Cripto-1在肝癌中的表达及与肝癌侵袭转移的关系，对探索肝癌的恶性进展机制以及寻找肝癌治疗的新靶点具有重要意义。

1　材料与方法

1．1肝癌标本Western blot所使用新鲜标本：选择2013年10月～2014年3月于安徽医科大学附属省立医院肝脏外科行手术切除的肝癌病例共14例，癌肿切除后立即刀片切取新鲜肝癌组织（选自癌组织边缘非坏死组织）、癌旁组织（选自癌肿与正常组织交界处2 cm以内），尽快-80℃条件保存备用。全部病例的病理检查均经本院病理科诊断为肝细胞性肝癌。另选2例因非肿瘤原因（外伤、结石）行肝部分切除的正常肝组织作为对照。免疫组织化学染色所使用蜡块标本：选择2006年1月～2011年1月于安徽医科大学附属省立医院行切除术的且本院病理科诊断为肝细胞性肝癌的蜡块标本82例，另取10例因非肿瘤原因（外伤、结石）行肝部分切除的正常肝组织作为对照。所有病例术前均未行放化疗等肿瘤相关治疗，且均有完整的临床病理资料。TNM分期遵从2002年国际抗癌联盟（UICC）第六次修订标准进行分期。肿瘤分化程度遵从Edmondson分级法进行分级。

1．2肝癌细胞株选取6株人肝癌细胞株Huh7、MHCC97-L、HepG2、MHCC97-H、HCCLM3、SK-Hep-1及一株正常肝细胞株L-O2。MHCC97-L、MHCC97-H及HCCLM3由肝胆胰外科安徽省重点实验室提供。正常肝细胞株L-O2及肝癌细胞株Huh7、HepG2、SK-Hep-1购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1．3主要试剂胎牛血清、DMEM培养基（美国Hyclone公司）；细胞培养所用培养瓶、6孔板等耗材（美国Corning公司）；Western blot所使用全蛋白提取试剂盒（南京凯基公司），PVDF膜（美国Milipore公司），ECL试剂盒（江苏碧云天公司）；Cripto-1、βactin抗体（美国Abcam公司）；免疫组织化学染色所使用SP试剂盒及DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物公司）。

1．4方法

1．4．1Western blot法测定Cripto-1蛋白表达根据凯基全蛋白提取试剂盒说明书操作提取组织和细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度；蛋白样品混合上样缓冲液后在沸水中加热5 min，取40μg上样，SDS-PAGE胶电泳分离蛋白；半干转膜法将蛋白转移至PVDF膜（0．22μm）上；5%脱脂奶粉室温封闭1 h；TBST漂洗PVDF膜3次，浸入1∶500稀释的Cripto-1抗体中4℃过夜；TBST洗膜3次，HRP二抗室温孵育2 h；TBST洗膜3次后ECL化学发光显影定影，曝光拍照；使用Image J软件检测条带灰度值。

1．4．2免疫组织化学染色石蜡包埋切片标本经二甲苯脱蜡和梯度酒精水化后，按抗体说明将切片浸入沸腾的0．01 mol／L枸橼酸缓冲液中微波炉解冻档加热修复抗原，使用生物笔进行组织圈定后滴加3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶活性10 min；PBS冲洗3次，滴加适量的Cripto-1抗体（1∶1 000稀释）覆盖切片，4℃条件下孵育过夜；PBS冲洗3次，滴加即用型二抗，室温孵育1 h；PBS冲洗3次，滴加适量新鲜配置的DAB显色液，显微镜下观察控制显色时间；滴加苏木素染液染色约1 min，PBS冲洗；经梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片后镜检并拍照。结果判定由与本实验无关的3位医师盲法观片并采用半定量计分法完成。每张切片随机选取3～5个有效高倍视野（肝癌细胞占绝大多数），胞质染色深度计分：无染色计0分、淡黄色计1分、棕黄色计2分、棕褐色计3分；阳性细胞百分比计分：无阳性细胞计0分、≤10%计1分、11%～50%计2分、＞50%计3分。总分（染色深度计分×阳性细胞百分比计分）0～4分为低表达（0分为阴性表达），5～9分为高表达。

1．5统计学处理采用SPSS 19．0统计软件进行分析，计量资料采用±s表示，采用独立样本的t检验和方差分析。率的比较采用X2检验或 Fisher精确概率法。

2　结果

2.1W estern blot检测肝癌组织和肝癌细胞株中Crip to-1蛋白的表达量Western blot结果表明Cripto-1蛋白在肝癌组织［64．3%（9／14）］中的表达显著高于与之配对的癌旁组织，见图1。在正常肝细胞株L-O2细胞株中未发现Cripto-1蛋白的表达，而在3株高侵袭肝癌细胞中发现明显高于低侵袭肝癌细胞株的Cripto-1蛋白表达量，见图2。MHCC97-L、MHCC97-H和HCCLM3人肝癌细胞株均是由MHCC97母细胞系连续筛选所得的转移潜能递增的细胞株，具有相似的遗传背景。3株人肝癌细胞株中Cripto-1蛋白条带与内参条带灰度的比值分别为0．317±0．036、0．562±0．052、0．689±0．076，差异有统计学意义（F＝34．941，P＜0．05）。以上结果表明Cripto-1蛋白在肝癌细胞株中的表达量与转移潜能呈正比。

2.3免疫组织化学染色检测肝癌组织切片中的Crip to-1蛋白的表达免疫组化染色结果显示Cripto-1表达主要定位于胞质，见图3。统计分析结果显示，Cripto-1在肝癌组织中的高表达率为64．6%（53／82），明显高于正常组织中的0%（0／10）。Cripto-1在肝癌组织中的表达与肿瘤的血管侵犯、肿瘤分化程度及转移情况相关（P＜0．05），而与患者性别、年龄、血清AFP水平、HBsAg状态、肝硬化及肿瘤的大小、数目、包膜情况和TNM分级等无明显相关性，见表1。

表1　Cripto-1在肝癌组织中的表达及与临床病理参数间的关系

3　讨论

Cripto-1作为一种胚胎干细胞的标志物，对其维持多能性和自我更新能力至关重要。然而研究［3］显示，Cripto-1的表达重新出现于多种人类肿瘤中，并且与多种人类常见肿瘤的组织病理分级密切相关，其中包括乳腺癌、胃癌、结肠癌、胆囊癌、子宫内膜癌等。在乳腺癌中，Cripto-1的表达明显高于良性乳腺肿瘤，尤其在侵袭性乳腺导管癌和小叶癌中高表达。而且Cripto-1的表达与乳腺癌的孕激素受体表达情况、肿瘤组织分级密切相关［4］。本研究证明Cripto-1可能是一种非特异性的肿瘤标志物，在肝癌中高表达而在非肿瘤肝组织中低表达或不表达，为肝癌的药物靶向治疗的研究指明了新的方向。另外其高表达与肝癌分化程度和侵袭转移的相关性，可能对肝癌的诊断和预后判断提供一定的帮助。

课题组之前的研究［5］证实胚胎成形素Nodal在肝癌恶性进展过程中发挥重要作用，在此基础上本实验继续对Nodal的辅助受体Cripto-1进行研究，证明Cripto-1在肝癌中高表达并且与肝癌的侵袭和转移有关。由此可以推测，Nodal／Cripto-1信号通路在肝癌的侵袭转移过程中可能发挥关键的调控作用。Cripto-1作为TGF-β超家族配体（Nodal、GDF-1、GDF-2）的辅助受体，共同调控胚胎时期细胞的EMT过程，并使细胞获得更强运动能力完成前后体轴和中-内胚层形成以及器官发育不对称性的建立［6］。在后天人体发育中，Cripto-1能够通过激活EMT促进乳腺上皮细胞的运动，对乳腺的发育成熟具有重要意义［7］。并且有证据表明Cripto-1在乳腺癌和宫颈癌细胞株中过表达能增强肿瘤细胞的运动能力［8］。高表达Cripto-1的乳腺上皮细胞表现出EMT趋势，并且伴随Wnt／β-Catenin、c-src／AKT等信号的激活。Cripto-1作为胚胎发育阶段的EMT诱导者，可能是通过EMT过程促进肝癌获得侵袭转移能力的。以上研究结果为继续深入研究Cripto-1促进肝癌侵袭转移的分子机制提供了理论依据。

复发和转移是肝癌研究的热点，Cripto-1被证实在胚胎性癌、黑色素瘤和前列腺癌细胞株中一小群具有干细胞样特性的细胞中表达［9-10］，高表达Cripto-1的细胞亚群可能是肿瘤复发、转移的根源。所以深入研究Cripto-1在肝癌中的表达和促进侵袭转移的分子机制具有重要的临床意义。

参考文献

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［3］Bianco C，Salomon D S．Targeting the embryonic gene Cripto-1 in cancer and beyond［J］．Expert Opin Ther Pat，2010，20（12）：1739-49．

［4］Strizzi L，Postovit L M，Margaryan N V，et al．Emerging roles of nodal and Cripto-1：from embryogenesis to breast cancer progression［J］．Breast Dis，2008，29：91-103．

［5］Chen J，Liu W B，JiaW D，etal．Embryonicmorphogen nodal is associated with progression and poor prognosis of hepatocellular carcinoma［J］．PLoSOne，2014，9（1）：e85840．

［6］Quail D F，Siegers G M，Jewer M，et al．Nodal signalling in embryogenesis and tumourigenesis［J］．Int J Biochem Cell Biol，2013，45（4）：885-98．

［7］Bianco C，Adkins H B，Wechselberger C，et al．Cripto-1 activates nodal-and ALK4-dependent and-independent signaling pathways in mammary epithelial Cells［J］．Mol Cell Biol，2002，22 （8）：2586-97．

［8］Watanabe K，Bianco C，Strizzi L，et al．Growth factor induction of Cripto-1 shedding by glycosylphosphatidylinositol-phospholipase D and enhancement of endothelial cell migration［J］．J Biol Chem，2007，282（43）：31643-55．

［9］Strizzi L，Abbott D E，Salomon D S，et al．Potential for cripto-1 in defining stem cell-like characteristics in humanmalignantmelanoma［J］．Cell Cycle，2008，7（13）：1931-5．

［10］Strizzi L，Margaryan N V，Gilgur A，et al．The significance of a Cripto-1 positive subpopulation of humanmelanoma cells exhibiting stem cell-like characteristics［J］．CellCycle，2013，12（9）：1450 -6．

Expression of Cripto-1 in hepatocellular carcinoma

Dai Shuai，Li Jiansheng，Xu Geliang，et al
（Dept of Hepatic Surgery，The Affiliated Provincial Hospital of AnhuiMedical University，Hefei230001）

AbstractObjectiveTo evaluate expression of Cripto-1 protein in hepatocellular carcinoma（HCC），nontumorous liver tissues，and HCC cell lines with variousmetastatic potentials，and determine the correlation between the expression level and HCCmetastatic potential．MethodsWestern Blot was used to evaluate Cripto-1 protein expression in HCC tumor tissues，nontumorous liver tissues and HCC cell lineswith variousmetastatic potentials．Immunohistochemistry was used to evaluate Cripto-1 expression in HCC tumor tissues，and determine the correlation between the expression level and clinicopathologiacal parameters．Resu ltsExpression level of Cripto-1 protein was higher in HCC tissues than their paired adjacent nontumorous liver tissues as well as normal liver tissues．Cripto-1 protein expression was positively correlated with metastatic potential of HCC cell lines．High Cripto-1 expression was detected in 64．6% （53／82）of HCC tumor tissues，and 0（0／10）in the normal liver tissues．Clinicopathological analysis on 82 HCC patients demonstrated that Cripto-1 expression was significantly associated with tumor differentiation，vascular invasion and status ofmetastasis（P＜0．05）．ConclusionThe expression level of Cripto-1 protein is elevated in HCC，and positively correlated with the invasion and metastasis of HCC．

Key wordshepatocellular carcinoma；Cripto-1；invasion；metastasis

中图分类号R 735．7

文献标志码A

文章编号1000-1492（2015）11-1645-04

基金项目：国家自然科学基金面上项目（编号：81272398）；安徽高校省级科学研究项目（编号：KJ2012Z179）

作者单位：安徽医科大学附属省立医院肝脏外科，合肥230001

作者简介：戴帅，男，硕士研究生；