RACK 1及其缺失突变体与CLIC1的共定位研究

王蓓华，朱亮亮，刘晓颖，范礼斌

RACK 1及其缺失突变体与CLIC1的共定位研究

王蓓华，朱亮亮，刘晓颖，范礼斌

摘要目的运用分子克隆技术构建活化蛋白激酶C受体1（RACK1）突变体的真核表达质粒，进行RACK1突变体的表达、定位及其与胞内氯离子通道蛋白1（CLIC1）蛋白的共定位研究，为其进一步的功能研究奠定基础。方法以RACK1全长cDNA序列为模板，构建真核表达质粒pcDNA3．1-RACK1-N（1-138）-FLAG、pcDNA3．1-RACK1-C（130-317）-FLAG；Western blot法检测突变体在哺乳动物细胞中的表达；用免疫荧光技术了解突变体蛋白在哺乳动物细胞中的共定位情况。结果成功构建了RACK1突变体的真核表达质粒；Western blot法检测到蛋白主要在胞质中表达，核内有部分表达；免疫荧光实验表明，RACK1及突变体蛋白主要定位在胞质与核膜，细胞核中也有少量表达，与CLIC1蛋白存在共定位。结论成功构建了RACK1缺失突变体，并在真核细胞中成功表达；RACK1及突变体与CLIC1蛋白在哺乳动物细胞中均存在不同程度的共定位，蛋白之间可能存在相互作用，为RACK1蛋白的功能研究奠定了基础。

关键词RACK1；质粒构建；转染；免疫荧光；Western blot

2015-06-15接收

刘晓颖，女，副教授，责任作者，E-mail：liuxiaoying＠ahmu．edu．cn；

范礼斌，男，教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：lfan＠ahmu．edu．cn

活化蛋白激酶C受体1（the receptor for activated C kinase 1，RACK1）基因，开放阅读框有1 142 bp，分子量为36 ku，由8个外显子和7个内含子组成，编码含317个氨基酸残基组成的蛋白质［1-2］。RACK1的整体结构与G蛋白β亚基的色氨酸-天冬氨酸40（WD40）重复区域高度同源，也是WD40家族中的一员，最初发现［3-4］是由于其能结合并局部激活蛋白激酶C（PKC），不同的RACKs与不同的PKC同工酶相互作用，其中RACK1与βⅡPKC作用［5-6］。RACK1能与多种信号分子如胞外蛋白调节激酶（ERK）、应激活化蛋白激酶（JNK）、β整合素、离子型谷氨酸受体（NMDA）等相互作用，参与调控细胞免疫应答，细胞生长分化，肿瘤发生、发展等［7］。该研究将构建的突变体与野生型的表达及定位进行比较，了解RACK1及其突变体与胞内氯离子通道蛋白1（CLIC1）蛋白在哺乳动物细胞中的共定位情况，为进一步确定RACK1的具体功能区域奠定了基础。

1　材料与方法

1．1材料

1．1．1细胞系COS7、HEK 293T、真核表达载体pcDNA3．1（＋）、感受态E．coli TG1细胞均为生物实验室保存。

1．1．2主要试剂pfu DNA polymerase（上海生工生物工程有限公司）；T4 DNA连接酶，DMEM高糖培养基（北京赛默飞世尔科技有限公司）；限制性内切酶HindⅢ、EcoRⅤ（加拿大Fermentas）；胶回收试剂盒（美国Axygen）；质粒提取试剂盒（美国OMEGA）；胎牛血清（美国 Hyclone）；LipofectamineTM2000、Opti-MEM（美国 Invitrogen）；Nuclear Extract （NE）buffer、Cytoplasmic Extract（CE）buffer、FLAG M2单抗（美国Sigma）；TRITC／FITC标记山羊抗小鼠IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）；荧光封片胶（丹麦DAKO公司）；PVDF膜（加拿大 BioBasic公司）；SuperSignal West Pico显色试剂盒（美国Pierce公司）。

1．2方法

1．2．1缺失突变体序列扩增突变体的构建基于真核表达载体pcDNA3．1（＋），见图1。根据目的基因序列和引物设计原则设计特异性PCR引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成，以RACK1全长cDNA序列为模板，以50μl PCR体系分别进行扩增，模板DNA10 ng，上下游引物各20 pmol，pfu DNA polymerase（5 U／μl）1μl。使用厂商推荐的PCR反应程序，最终产物由1．2%的琼脂糖凝胶电泳分离，用凝胶回收试剂盒回收。

1．2．2缺失突变体的构建扩增产物分别用限制性内切酶HindⅢ、EcoRⅤ进行双酶切，1．2%的琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶回收试剂盒回收。酶切产物与相应的酶切载体经T4 DNA连接酶，于16℃连接过夜；连接产物分别转化感受态细胞TG1，均匀涂布于含氨苄抗性的LB培养皿上，37℃倒置培养约12 h；挑取单克隆在含有氨苄抗性的LB培养基中37℃震荡过夜；抽取质粒后双酶切鉴定，将阳性克隆的菌液送公司测序。

1．2．3Western blot检测蛋白表达及定位HEK 293T细胞和COS7细胞在5% 胎牛血清的高糖DMEM培养基中培养，LipofectamineTM2000与重组质粒的比例为1∶1。转染48 h后收集细胞，用预冷的PBS洗涤1次，弃尽PBS，用5倍体积的CE buffer重悬细胞，冰浴并间隔震荡5 min，3 000 r／min离心收集上清液，加等量2×SDS loading buffer，沸水浴5 min备用；余下沉淀用不含NP-40的CE buffer洗涤3次以除尽胞质蛋白，加入与沉淀等体积的NE buffer，冰浴并间隔震荡10 min，3 000 r／min离心收集上清液，加等量2×SDS loading buffer，沸水浴5 min，SDS-PAGE胶电泳分离；100 V，湿转1 h；室温下PVDF膜在5%脱脂奶粉封闭液中孵育2 h，FLAG单抗（1∶500）4℃孵育过夜，TBST充分漂洗；二抗（1∶5 000）室温孵育1 h，TBST充分漂洗；ECL显色试剂盒显影。

1．2．4荧光定位COS7细胞在5%胎牛血清的高糖DMEM培养基中培养，转染前1 d在35 mm皿中置盖玻片接种一定数量的细胞，使得转染当天细胞汇合度达50%以上。分别转染野生型RACK1表达质粒及其缺失突变体，LipofectamineTM2000与重组质粒的比例为1∶1；转染6 h后换正常培养基培养；24 h后固定细胞，FLAG M2单抗孵育2 h，TRITC／FITC标记山羊抗小鼠IgG孵育1 h，DAPI染核后，荧光封片胶封片；4℃存储过夜，激光共聚焦显微镜观察定位情况。

2　结果

2.1RACK 1缺失突变体的构建与鉴定扩增的PCR产物和载体经过双酶切后产生相同的粘性末端，通过连接酶连接，形成重组质粒，其中仅含有单个酶切位点，如果构建成功，酶切鉴定时会在相应位置出现目的条带，见图2。测序结果进一步证实目的片段正确插入到pcDNA3．1（＋）载体中。

2.2RACK 1及其缺失突变体在细胞核、细胞质中的表达转染48 h后，收集细胞，Western blot法检测蛋白表达，见图3。A、B图分别为野生型和突变体在细胞核、细胞质中的表达结果，与目的蛋白分子量一 致，即RACK1-FLAG、RACK1-N-FLAG和RACK1-C-FLAG的分子量分别为36、16和21 ku。由于野生型RACK1和突变体RACK1-N在HEK 293T细胞中正常表达，突变体 RACK1-C在HEK 293T中表达过低（免疫荧光实验显示在HEK 293T中也能够表达，数据未显示），所以这里用COS7细胞进行RACK1-C的蛋白表达实验。

2.3RACK1缺失突变体在COS7中的定位转染24 h后经激光共聚焦显微镜观察，见图4A。野生型RACK1主要在胞质中表达且存在斑块状分布，核膜处表达增多，细胞核中也有部分表达；缺失突变体pcDNA3．1-RACK1-N和pcDNA3．1-RACK1-C主要在胞质中呈斑点状分布，细胞核中也有少量表达，野生型与突变体蛋白在COS7细胞中的定位未发生明显变化。RACK1及其缺失突变体质粒分别与CLIC1质粒共转入COS7中，结果见图4B。CLIC1在胞质、胞核及核膜处均有明显的表达，与RACK1及缺失突变体均有有共定位存在。

3　讨论

本研究将RACK1突变体（N端和 C端）构建于真核表达载体pcDNA3．1（＋），分别转染至HEK 293T和COS7细胞中，初步了解其在真核细胞中的表达和定位。结果显示，野生型RACK1主要分布在胞质与核膜处，细胞核中有少量表达；缺失突变体pcDNA3．1-RACK1-N和pcDNA3．1-RACK1-C主要呈斑块状分布于细胞质，细胞核中表达较少，突变体和野生型的细胞定位未发生明显变化；野生型RACK1及其两个突变体与CLIC1蛋白均存在部分共定位，提示蛋白之间可能存在相互作用。本实验室已经通过其他实验证实野生型RACK1蛋白与CLIC1蛋白存在相互作用（数据未发表）。

接下来将RACK1及其两个突变体构建到原核表达载体pGEX-5X-3中，诱导GST融合蛋白表达，进行GST-pulldown实验，并结合co-IP实验进一步验证RACK1突变体蛋白与CLIC1蛋白是否存在相互作用。

互作蛋白能够特异性结合RACK1特定的WD区域，如PKCβ、Src、PDE4D5、干扰素受体等的结合区域都在WD5-7范围［8］，该区域属于功能区域。本研究所构建的突变体RACK1-N包含了WD1-3区域，突变体RACK1-C涵盖了WD5-7区域，为后续RACK1的功能研究、确定与其互作蛋白结合的精细结构等研究奠定了基础。研究［9］表明RACK1参与离子通道的功能，pkd2L1能够通过Ca2＋、Na＋、K＋，是一种非选择性的阳离子通道，RACK1的WD6与WD7结构域能够与pkd2L1的Ala19-Pro45片段相互作用。在中枢神经系统中，RACK1可与GABAA受体（GABAAR）的胞浆区结合［10］，GABAAR是一种配体门控氯离子通道，所以对RACK1是否与胞内氯离子通道蛋白相互作用具有一个很好的提示。本研究中的免疫荧光实验结果证实RACK1及其突变体蛋白与氯离子通道蛋白1（CLIC1）存在共定位，提示蛋白之间可能存在相互作用。RACK1蛋白表达广泛，有100多种蛋白与RACK1相互作用，这些蛋白绝大多数已证实作为RACK1的结合伴侣，通过RACK1进行功能调节［11-14］。关于RACK1和CLIC1结合的生理功能研究有待进一步探索。

参考文献

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The co-localization of RACK1 and itsmutants w ith CLIC1

Wang Beihua，Zhu Liangliang，Liu Xiaoying，et al
（Dept of Biology，AnhuiMedical University，Hefei230032）

AbstractObjective To construct the eukaryotic expression plasmids of the receptor for activated C kinase 1

（RACK1）mutants using molecular cloning techniques and observe the expression and cellular localization of RACK1 mutants and their co-localization with chloride intracellular channel protein 1（CLIC1）for further study on the cellular functions of RACK1 protein．MethodsRACK1 mutants were amplified by PCR with the template including the full length cDNA fragment of RACK1．Eukaryotic plasmids pcDNA3．1-RACK1-N（1-138）-FLAG，pcDNA3．1-RACK1-C（130-317）-FLAG were constructed respectively．The cellular expression and localization of RACK1 and itsmutants inmammalian cellswere detected byWestern blotand confocal fluorescencemicroscopy respectively．Resu ltsAll the plasmids of RACK1 mutantswere successfully constructed．Western blot and confocal fluorescencemicroscopy results indicated that RACK1 and itsmutants localized both in cytoplasm and nucleus，mainly in cytoplasm．The co-localization existed between RACK1 and CLIC1，and themutants of RACK1 had similar co-localization with CLIC1．ConclusionRecombinant plasmids of RACK1 mutants are constructed successfully and express effectively in eukaryotic cells．RACK1 protein and itsmutants appear to co-localizewith CLIC1 respectively，which implies that RACK1 and itsmutantsmay interact with CLIC1 respectively in mammalian cells．The study is very important for exploring the function of RACK1．

Key wordsRACK1；recombinant plasmids；transfection；fluorescence；Western blot

中图分类号R 349．65；R 349．83

文献标志码A

文章编号1000-1492（2015）11-1543-05

基金项目：国家自然科学基金青年基金（编号：81201368）

作者单位：安徽医科大学生命科学学院生物学系，合肥230032

作者简介：王蓓华，女，硕士研究生；