补体成分C3及其缺失突变体蛋白的表达及与CLIC1蛋白共定位的研究

王二宁，陈丹丹，刘晓颖，范礼斌

补体成分C3及其缺失突变体蛋白的表达及与CLIC1蛋白共定位的研究

王二宁，陈丹丹，刘晓颖，范礼斌

摘要目的研究补体成分C3及其缺失突变体C3（1-840）、C3（824-1663）在真核细胞内的表达及与氯离子通道蛋白（CLIC1）的共定位。方法构建pcDNA3．1-C3-FLAG、pcDNA3．1-C3（1-840）-FLAG、pcDNA3．1-C3（824-1663）-FLAG三个真核表达质粒（缺失突变体根据C3的结构域及其裂解断裂位置设计），并分别转染至HEK 293T细胞中，Western blot检测表达情况；上述质粒分别瞬时单转至COS7细胞和分别与GFP-CLIC1共转至COS7细胞内，观察共定位情况。结果成功构建带FLAG标签的C3基因及其两个缺失突变体［C3（1-840）、C3（824-1663）］的真核表达载体，Western blot结果显示它们在HEK 293T细胞中均能成功表达；免疫荧光显示它们在COS7细胞中均主要分布于细胞质，且三个真核表达载体中只有C3（824-1663）与CLIC1有共定位。结论补体C3及其缺失突变体C3（1-840）和C3 （824-1663）在HEK 293T、COS7细胞中均能高效表达，且主要分布在细胞质内，C3（824-1663）与CLIC1蛋白有共定位。

关键词C3；转染；基因表达；定位

2015-06-20接收

刘晓颖，女，副教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：liuxiaoying＠ahmu．edu．cn；

范礼斌，男，教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：lfan＠ahmu．edu．cn

补体是存在于血清及组织液中的一组具有酶活性的球蛋白，主要是由巨噬细胞、单核细胞、淋巴细胞、骨髓、腹膜和肝脏等合成的一种β球蛋白［1］。补体系统由30多种血浆蛋白和血细胞受体组成，约占血清总蛋白的10%，其中补体成分C3（complement component，C3）在血清中含量最高，是在补体系统中起关键作用的成分［1］。人体内的补体系统共有三条激活途径，分别称为经典、旁路和甘露聚糖结合凝集途径，三条途径均是独立的，但都需要经过C3的裂解，激活途径才能启动［2-3］。因此，C3是所有补体介导炎症反应的必需因子和汇合点［1］。从原始的脊椎动物和无脊椎动物中发现了组成补体系统的有关成分如C3和B因子，同时也能检测出补体活性［4］。因此，补体作为独立的先天性免疫防御机制，出现远远早于特异性免疫，表明补体系统在进化起源上比较早［5-6］。无论是先天性还是特异性的免疫都是无可替代的。

该研究通过构建下游带有FLAG标签的真核表达质粒即pcDNA3．1-C3-FLAG、pcDNA3．1-C3（1-840）-FLAG、pcDNA3．1-C3（824-1663）-FLAG，然后分别转染至HEK 293T和COS7细胞中，来研究其在真核细胞内的表达及其和氯离子通道蛋白（CLIC1）的共定位情况。

1　材料与方法

1．1质粒、菌株和细胞含人C3全长cDNA序列的质粒由韩家淮教授实验室惠赠，pcDNA3．1（＋）真核表达载体、TG1感受态菌株、COS7和HEK 293T细胞株均由本实验室-80℃保存。

1．2主要试剂与仪器引物合成由上海生工生物有限公司完成，DNA Polymerase酶（日本TaKaRa公司），AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（美国 Axygen公司），HindⅢ、XhoⅠ、EcoRⅠ、EcoRⅤ限制性内切酶、T4 DNA连接酶及Lambda DNA EcoR I＋Hind IIIMarker（加拿大Fermentas公司），DMEM培养基与胎牛血清（美国Thermo公司）；Lipofectamine 2000 Reagent、Opti-MEM Reduced serum Medium（上海 Invitrogen公司）；辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠lgG和山羊抗小鼠IgG／TRITC（北京中杉金桥公司）；Western及IP细胞裂解液和一抗二抗稀释液（中国上海碧云天公司）；Monoclonal anti-FLAG M2一抗（美国Sigma公司）；ECL显色试剂盒（美国Pierce公司）；Leica DMI 6000型荧光显微镜（德国Leica公司）。

1．3方法

1．3．1质粒构建［7］根据基因序列设计下游带FLAG标签的C3及C3（-1840）和C3（824-1663）的引物，利用PCR法从含人C3全长cDNA序列的质粒中扩增出C3及 C3（1-840）和 C3（824-1663），通过聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖电泳，胶回收PCR产物，用限制性内切酶分别对pcDNA3．1（＋）载体和PCR产物进行双酶切，用T4 DNA连接酶16℃孵育13 h左右，连接产物转化TG1感受态细胞，培养8～10 h，挑取单克隆进行摇菌，37℃恒温培养12 h后抽提质粒，并用限制性内切酶进行酶切鉴定，鉴定正确的质粒送公司测序。见表1。

表1　引物序列

1．3．2细胞培养蛋白表达实验中，对HEK 293T细胞进行传代，并且以适当密度接种至60 mm的培养皿中（不含双抗培养基），待转染。在荧光定位实验中，在30 mm培养皿中放入经高压灭菌、多聚赖氨酸包被的盖玻片，充分晾干。同时，对COS7细胞进行传代，并以1×105～2×105／cm2的密度接种于铺有盖玻片的30 mm培养皿中，待转染。置5% CO2、37℃恒温培养箱中培养过夜。

1．3．3质粒转染在蛋白表达实验中，待前一天接种的HEK 293T细胞长至80%～90%的汇合度时，根据Lipofectamine 2000试剂盒提供的方法转染细胞，把培养皿置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。6 h后更换为新鲜的DMEM培养基，继续培养；在荧光定位实验中，COS7细胞长到30%～40%的汇合度即可进行转染。

1．3．4免疫荧光制片［8］转染后约 24 h，取出长有COS7细胞的盖玻片，用PBS清洗；-20℃预冷的甲醇固定2 min，70%的乙醇固定5 min，PBS清洗3次，每次5 min；含1%脱脂奶粉的TBST溶液封闭30 min，弃封闭液；FLAG一抗（1∶100，用封闭液配制）室温孵育2 h，回收一抗，PBS清洗3次，每次5 min；TRITC标记的山羊抗小鼠IgG二抗（1∶1 000，用封闭液配制）室温孵育1 h，弃二抗；PBS清洗3次，每次5 min；0．15 g／L DAPI溶液染核，室温2 min，弃DAPI溶液；PBS清洗3次，每次5 min；滤纸尽可能吸去盖玻片上的残液，荧光封片胶（Dako）把盖玻片封于洁净载玻片上；4℃保存过夜，荧光显微镜进行观察和拍照。

1．3．5Western blot检测C3及缺失突变的表达［9］转染后约48 h，在冰上用细胞裂解液裂解HEK 293T细胞约30 min，然后4℃、14 000 r／min离心20 min，收集上清液；取出部分上清液加入等量2×SDS上样缓冲液混合，沸水浴5 min，冰浴3 min；SDSPAGE电泳2 h，100 V恒压电转1．5 h；取出PVDF膜，含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭2 h，TBST清洗。FLAG一抗（1∶500，用一抗稀释液稀释）4℃孵育过夜，TBST清洗；辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG（1∶5 000，用封闭液稀释）室温孵育1 h，用TBST清洗；使用ECL试剂盒在暗室中用X线片曝光之后显影和定影，X线片晾干后进行扫描。

2　结果

2.1pcDNA3.1-C3-FLAG、pcDNA3.1-C3（1-840）-FLAG、pcDNA3.1-C3（824-1663）-FLAG真核表达载体的构建对抽提的质粒pcDNA3．1-C3-FLAG、pcDNA3．1-C3（1-840）-FLAG、pcDNA3．1-C3 （824-1663）-FLAG分别进行双酶切鉴定，结果如图1所示，以上质粒都被切出两条亮带，经过跟Marker比较，一条带大小约为5．4 kbp，与载体pcDNA3．1的大小基本一致，另一条分别与各自的目的片段大小一致，表明连接成功，测序结果进一步表明质粒构建正确。

M：Lambda DNA EcoR I＋Hind IIIMarker；A：质粒酶切产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果；B：质粒酶切产物的琼脂糖凝胶电泳结果；1、2：pcDNA3．1-C3-FLAG的酶切鉴定产物；3、4：pcDNA3．1-C3（1-840）-FLAG的酶切鉴定产物；5、6：pcDNA3．1-C3（824-1663）-FLAG的酶切鉴定产物

2.2C3及其缺失突变体蛋白在哺乳动物细胞中的表达情况对转染了pcDNA3．1-C3-FLAG、pcDNA3．1-C3（1-840）-FLAG和pcDNA3．1-C3（824-1663）-FLAG的HEK 293T细胞进行Western blot检测，结果显示裂解液都能检测相应的目的条带，与预染的蛋白Marker进行对比，pcDNA3．1-C3-FLAG、pcDNA3．1-C3（1-840）-FLAG及pcDNA3．1-C3（824-1663）-FLAG的条带与预期一致，即分别为187、105 和105 ku。表明C3及其C3（1-840）和C3（824-1663）在HEK 293T细胞中能够正常表达。见图2。

1、2、3：分别转染pcDNA3．1-C3-FLAG、pcDNA3．1-C3（1-840）-FLAG、pcDNA3．1-C3（824-1663）-FLAG的HEK 293T细胞裂解液

2.3C3及其缺失突变体C3（1-840）和C3（824-1663）在COS7细胞中的定位COS7细胞在分别转染pcDNA3．1-C3-FLAG、pcDNA3．1-C3（1-840）-FLAG和 pcDNA3．1-C3（824-1663）-FLAG，继续培养24 h后，根据1．3．5中的方法进行免疫荧光制片，荧光显微镜下观察定位情况。结果表明三者均主要定位在细胞质中，细胞核内几乎没有，但是pcDNA3．1-C3（824-1663）-FLAG在细胞质中靠近核膜一侧有斑块状集中分布。见图3。

2.4C3及其缺失突变体蛋白与CLIC1蛋白在COS7细胞中的共定位将C3及其缺失突变体分别与GFP-CLIC1共转至COS7细胞中，继续培养24 h后，根据1．3．5中的方法进行免疫荧光制片，荧光显微镜下观察定位情况。结果显示，全长C3和C3 （1-840）与CLIC1蛋白没有共定位，但是C3（824-1663）与CLIC1蛋白有共定位现象，主要共定位在细胞质中。有无共定位判断依据是选择两种蛋白分布的同一个点或者位置进行比较，观察分布是否相同再通过叠加图比较。见图4。

3　讨论

该研究通过构建含有C3全长基因及其缺失突变体C3（1-840）、C3（824-1663）的3个真核表达质粒，并分别转染至HEK 293T、COS7等真核细胞内，通过免疫荧光和免疫印迹技术，检测C3全长基因及其缺失突变体C3（1-840）、C3（824-1663）在真核细胞内的表达和定位情况。根据文献［10］报道，标签在上游有可能对蛋白表达产生一定影响，所以在基因的下游加入了FLAG标签。蛋白表达实验中，Western blot检测HEK 293细胞内的C3及其缺失突变体C3（1-840）、C3（824-1663）蛋白都能正常表达。共定位实验通过免疫荧光或者GFP融合蛋白表达的方法借助荧光显微镜观察，若蛋白共定位，则作为该两个蛋白有相互作用的一个佐证，从而推断蛋白的功能，荧光显微镜观察发现，C3及其缺失突变体蛋白主要都定位在细胞质中，共定位实验表明C3 （824-1663）与CLIC1蛋白在细胞质中有共定位现象，这将为研究C3这种大分子蛋白通过裂解形成片段与CLIC1相互作用提供一定的基础。对于定位和表达选择两种细胞的理由是：一种是COS7细胞，该细胞特点是细胞核较大在荧光显微镜下观察，能够比较清晰观察该重组蛋白在细胞中的分布；另一种是HEK 293T细胞，该细胞特点是细胞生长快且转染效率比较高，易于表达蛋白。

哺乳动物补体系统的主要功能包括宿主防御微生物，消除免疫复合物和细胞凋亡，促进适应性的免疫反应［11］。其中补体C3起着关键性作用，因为3条补体途径的激活都要通过活化C3才得以实现［12-13］，C3在C3裂解酶的作用下进一步裂解，参与许多补体的激活［11］。补体C3由A链和B链通过二硫键连接而成，C3基因位于第19号染色体，长约41 kbp，编码1 663个氨基酸。C3蛋白为187 ku，属于α2-巨球蛋白家族（α2M）。C3为2个肽链结构分别为α链和β链，由13个结构域构成［11］：MG1-8、LINK、ANA、CUB、TED和Anchor。越来越多的研究［12］表明，许多疾病都与C3的变化有关。例如：抗原-抗体复合物引起的胃炎患者血清总补体和C3均明显下降。大多数全身性红斑狼疮患者血清补体的降低和病情恶化有关，活动性全身性红斑狼疮患者血清中C1、C2、C4和C3降低，病情缓解时血清补体水平恢复正常。肿瘤患者补体量升高，特别是肝癌，C3升高最为明显，具有临床诊断意义。因此对于补体成分C3的研究意义重大。

本研究结果表明补体C3及其缺失突变体在HEK 293T细胞中能够正常表达，在COS7细胞中主要定位在细胞质中，只有缺失突变体C3（824-1663）与CLIC1有共定位。这将为本课题组在以后研究蛋白质的相互作用提供依据。

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The expression of human com p lement component C3 and its deletion mutants and the colocalization w ith CLIC1

Wang Erning，Chen Dandan，Liu Xiaoying，et al
（Dept of Biology，AnhuiMedical University，Hefei230032）

AbstractObjectiveTo study the expression and cell localization of complement component C3 and its deletion mutants C3（1-840）and C3（824-1663）in eukaryotic cells and the colocalization with CLIC1．MethodsTo construct three eukaryotic expression plasmids of pcDNA3．1-C3-FLAG，pcDNA3．1-C3（1-840）-FLAG and pcDNA3．1-C3（824-1663）-FLAG（according to C3 structure domain and splitting position）．The plasmidswere transfected into HEK 293T cells．Then the expression was detected by Western blot，and their cellular localization was detected in COS7 cells by fluorescence microscopy．ResultsThe eukaryotic expression plasmids of pcDNA3．1-C3-FLAG，pcDNA3．1-C3（1-840）-FLAG and pcDNA3．1-C3（824-1663）-FLAG were constructed successfully，which could be expressed in HEK 293T and COS7 cells，and the cellular localization of C3 and C3（1-840），C3（824-1663）appeared similar，mainly in the cytoplasm，and only C3（824-1663）co-localized in the cytoplasm with CLIC1．ConclusionComplement C3 and its deletion mutants C3（1-840），C3（824-1663）can be effectively expressed in HEK 293Tand COS7 cells，and all of them aremainly distributed in the cytoplasm and C3（824-1663）co-localized in the cytoplasm with CLIC1．

Key wordsC3；transfection；gene expression；localization

中图分类号Q 28；R 392．7

文献标志码A

文章编号1000-1492（2015）11-1533-05

基金项目：国家自然科学基金青年基金（编号：81201368）

作者单位：安徽医科大学生命科学学院生物教研室，合肥230032

作者简介：王二宁，男，硕士研究生；