IL-6RFP在小鼠血吸虫感染中对肝细胞的保护作用

平春光，程海燕，高闻达，计永胜，刘　淼，任翠平，邵延靖，华梦晴，沈际佳

IL-6RFP在小鼠血吸虫感染中对肝细胞的保护作用

平春光1，程海燕1，高闻达2，计永胜1，刘淼1，任翠平1，邵延靖1，华梦晴1，沈际佳

摘要目的探讨鼠白介素6受体融合蛋白（m IL-6RFP）在BALB／c小鼠日本血吸虫感染模型中对肝细胞的保护作用。方法通过亲和层析方法获得可阻断白介素-6（IL-6）的m IL-6RFP，经人类肝癌细胞（HepG2）IL-6刺激及阻断实验检测纤维蛋白原（fibrinogen，FGG）和结合珠蛋白（haptoglobin，HP）的mRNA表达变化，体外验证重组蛋白m IL-6RFP的生物活性。建立BALB／c小鼠日本血吸虫感染模型，于感染第24天起经尾静脉注射m IL-6RFP，隔天注射每次100μg／只，感染第42天剖杀小鼠。HE染色法检测小鼠肝脏肉芽肿面积，荧光定量PCR法检测小鼠肝组织IL-1β、IL-13、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和趋化因子1（CXCL1）的mRNA表达，连续监测法检测小鼠肝功能指标谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）。结果HepG2细胞实验显示m IL-6RFP可降低IL-6对该细胞的刺激作用，显著下调FGG和HP的表达（P ＜0．05）。在小鼠感染模型中阻断IL-6后，肝功能指标ALT和AST与溶剂对照组相比均显著下降（P＜0．05），肉芽肿病变无显著性差异。结论在BALB／c小鼠日本血吸虫感染模型中m IL-6RFP可明显改善肝细胞功能，但对肉芽肿形成未见明显作用。

关键词IL-6；日本血吸虫；BALB／c小鼠

2015-05-20接收

2美国安泰吉生物技术与制药有限公司，波士顿02118

沈际佳，男，教授，博士生导师，责任作者，E-mail：shenjijia ＠hotmail．com

血吸虫病是一种严重危害人类健康的寄生虫病，目前我国仍是日本血吸虫病流行最严重的国家之一。血吸虫病主要致病机制是虫卵引起的肝脏肉芽肿和纤维化［1］。白细胞介素-13（interleukin-13，IL-13）在BALB／c小鼠日本血吸虫感染模型肝脏肉芽肿和纤维化的形成中发挥重要作用，感染鼠IL-13水平明显升高，阻断IL-13后纤维化可显著改善［2-3］。细胞因子IL-17在C57BL／6小鼠日本血吸虫感染模型肝脏肉芽肿的形成中也发挥重要作用，感染鼠IL-17显著升高，采用中和抗体阻断IL-17，小鼠肝脏肉芽肿病变和肝功能损伤都显著减轻［4］。有报道［5］指出在大鼠败血症模型中IL-6显著升高，阻断IL-6可显著降低肝细胞损伤。此外，IL-6在免疫性疾病中可介导免疫损伤［6］。前期研究［4］显示IL-6在小鼠日本血吸虫感染模型中显著升高，但IL-6在血吸虫病发病机制中的作用尚不明确。该研究旨在探讨鼠白介素6受体融合蛋白（mouse interleukin-6 receptor fusion protein，m IL-6RFP）在BALB／c小鼠日本血吸虫感染模型中对肝细胞的保护作用。

1　材料与方法

1．1实验材料

1．1．1主要试剂低糖DMEM培养基、胎牛血清和M-MLV逆转录酶购自美国Invitrogen公司；重组人白介素-6（recombinant human interleukin-6，rhIL-6）购自上海普欣生物技术有限公司；SYBR Premix Ex Taq II定量PCR试剂盒购自大连宝生物技术有限公司；BCA蛋白定量检测试剂盒、总蛋白提取试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）检测试剂盒（连续监测法）、谷草转氨酶（aspartate transaminase，AST）检测试剂盒（连续监测法）购自上海荣盛生物药业有限公司；引物合成由上海生工生物工程有限公司完成；重组蛋白m IL-6RFP由安徽医科大学病原生物学教研室纯化获得；质粒pcDNA3．1携带鼠IL-6受体融合蛋白基因序列（m IL-6RFP-pcDNA3．1）由美国波士顿Antagen生物制药研究所高闻达教授惠赠；本研究所用其它试剂均为国产分析纯。

1．1．2细胞株及实验动物人类肝癌细胞（HepG2）购自中科院上海细胞库；SPF级BALB／c小鼠，6～8周龄，雌性，购自安徽省实验动物中心；日本血吸虫感染阳性钉螺购自江苏省血吸虫病防治研究所。

1．2实验方法

1．2．1m IL-6RFP活性验证取对数生长期HepG2细胞，接种于6孔板中，细胞癌度为2．5×105／m l，2 m l／孔，完全低糖DMEM（含10%FBS、100 IU／m l双抗），37℃、5%CO2、饱和湿度培养24 h。HepG2细胞饥饿处理，将完全低糖DMEM更换成不含血清的低糖DMEM，继续培养24 h［7］，再将培养基更换成完全低糖DMEM。参照文献［8］设置如下实验，正常对照组不做任何特殊处理；IL-6刺激组添加rhIL-6，使其终浓度为100 ng／ml；IL-6阻断组，rhIL-6和m IL-6RFP以分子数之比为1∶40混合、37℃孵育30 min后将混合物添加到相应培养孔；溶剂对照组添加与IL-6阻断组等体积的蛋白溶剂。各组添加相应试剂后继续培养4 h，收集各孔细胞。以上实验重复3次。

1．2．2HepG2细胞总 RNA提取和RT-PCR6孔板中各组细胞用预冷的PBS洗2次，每孔加TRIzol试剂1 ml，反复吹打后转移到1．5 m l EP管，提取总RNA。采用Nano Drop仪器检测RNA浓度后，根据M-MLV逆转录酶说明书将总RNA逆转录成cDNA。按照SYBR Premix Ex Taq II定量PCR试剂盒的操作步骤配制RT-PCR反应体系20μl，设置反应条件，采用GAPDH作为本实验的内参，采用2-ΔΔCt法对RT-PCR数据进行分析，判断各组细胞纤维蛋白原（fibrinogen，FGG）和结合珠蛋白（haptoglobin，HP）的mRNA表达差异。本次及后续定量PCR实验所需引物见表1。

表1　引物序列

1．2．3实验动物模型及IL-6阻断18只BALB／c小鼠随机分成正常对照组、溶剂对照组和IL-6阻断组。将感染了日本血吸虫的阳性钉螺置于25～28℃温水中，用白炽灯照射至尾蚴逸出，IL-6阻断组和溶剂对照组每鼠经腹部皮肤感染尾蚴（20±2）条。IL-6阻断组小鼠感染第24天开始经尾静脉注射m IL-6RFP、每隔1 d注射、每次100μg／只，直至第40天注射最后1次，第42天剖杀。溶剂对照组注射等体积的蛋白溶剂，方法同IL-6阻断组。正常对照组不做任何特殊处理。

1．2．4标本采集小鼠于感染第42天剖杀、采集所需标本。小鼠全血采集后于37℃温箱静置1 h，3 000 r／min离心10 min，分离血清，-80℃保存。采集肝脏标本，采集肝左叶用10%福尔马林固定；从相同部位采集2块肝脏，每块约0．1 g，分别用于RT-PCR检测和虫卵计数。

1．2．5小鼠肝脏虫卵计数将肝脏置于青霉素瓶，每0．1 g肝脏加1 ml 5%KOH溶液，充分剪碎，37℃温箱消化3 h，期间每0．5 h晃动1次以促进消化。消化结束后充分混匀，每次吸取20μl涂片，普通光学显微镜下（×40）计虫卵数，每鼠计数3次，取平均数。

1．2．6小鼠肝脏肉芽肿病变检测取10%福尔马林固定的肝组织，石蜡包埋，切片厚度4μm，每鼠切3个部位，每部位1张切片。经HE染色，普通光学显微镜下（×40）拍照，采用 Image Tool 3．0软件分别圈出每张切片的肉芽肿面积和总面积，分别计算IL-6阻断组和溶剂对照组中每只小鼠肉芽肿面积所占比例。

1．2．7小鼠血清ALT和AST检测采用连续监测法检测血清 ALT和 AST的活性。试剂1和试剂2按照4∶1的比例混匀即为工作液，将50μl血清加入1 ml工作液中混匀，分别检测样本混匀后1、2、3 min时的吸光度值（absorbance，A）A1、A2和A3，波长340 nm。计算平均变化吸光度（ΔA／min）。浓度换算按如下公式：ALT（IU／L）＝ΔA／min×3 376。AST检测和换算方法与ALT相同。

1．2．8小鼠肝脏组织总RNA提取和RT-PCR将肝脏组织从RNAlater溶液中取出，放入TRIzol溶液中，充分剪碎后电动匀浆器匀浆，提取总RNA。采用Nano Drop仪器检测RNA浓度后，根据M-MLV逆转录酶说明书将总RNA逆转录成cDNA。按照SYBR Premix Ex TaqⅡ定量PCR试剂盒的操作步骤配制RT-PCR反应体系20μl，设置反应条件，采用β-actin作为本实验的内参，采用2-ΔΔCt法对RTPCR数据进行分析，判断各组肝组织中IL-1β、IL-13、TNF-α和CXCL1的mRNA表达差异。

1．3统计学处理运用SPSS 17．0软件进行分析，实验数据以±s表示，两组间均数的比较采用t检验；多组均数的比较采用单因素方差分析，并采用LSD法进行两两比较。

2　结果

2.1m IL-6RFP的体外生物活性验证FGG和HP 的mRNA表达水平在正常对照组、IL-6刺激组、IL-6阻断组和溶剂对照组中的差异均有统计学意义（F ＝40．593、111．687，P＜0．05）。两两比较显示，FGG 和HP的mRNA表达水平在正常对照组和溶剂对照组中的差异均无统计学意义。IL-6阻断组中FGG和HP的mRNA表达水平均低于IL-6刺激组，差异均有统计学意义（P＜0．05）。说明m IL-6RFP具有阻断IL-6的生物活性。见图1。

2．2肝脏虫卵计数各组小鼠于血吸虫尾蚴感染第42天剖杀，小鼠肝脏虫卵计数结果显示溶剂对照组和IL-6阻断组虫卵密度比较差异无统计学意义，表明两组感染程度一致，后续实验具有可比性，见图2。

2．3肝脏肉芽肿病变检测小鼠肝脏切片经HE染色，溶剂对照组和IL-6阻断组均能观察到明显的肉芽肿病变，说明造模成功，见图3B、3C。小鼠肝脏切片经HE染色后采用Image Tool 3．0软件处理，分别计算溶剂对照组和IL-6阻断组中每只小鼠肉芽肿面积所占比例，溶剂对照组和IL-6阻断组肉芽肿面积比例无差异，见图3D。

2.4肝功能指标ALT和AST检测ALT和AST的活性在正常对照组、溶剂对照组和IL-6阻断组中的差异均有统计学意义（F＝48．600、41．476，P＜0．05）。正常对照组小鼠肝功能指标ALT均值为26 IU／L，AST均值为30 IU／L，两者都在正常范围（＜40 IU／L）。溶剂对照组小鼠肝功能指标ALT均值为306 IU／L，AST均值为348 IU／L；IL-6阻断组小鼠在阻断IL-6后肝功能指标ALT均值为135 IU／L，AST均值为175 IU／L。两两比较中，ALT和AST的活性在IL-6阻断组中均低于溶剂对照组，差异均有统计学意义（P＜0．05）。说明IL-6阻断组中m IL-6RFP蛋白对血吸虫感染小鼠肝功能指标ALT和AST活性均起到明显的降低作用。见图4。

2.5细胞因子和趋化因子mRNA水平检测IL-1β、IL-13、TNF-α和CXCL1的mRNA水平表达在正常对照组、溶剂对照组和IL-6阻断组中的差异均有统计学意义（F＝20．365、9．020、20．514、31．654，P ＜0．05）。两两比较中，IL-1β、IL-13、TNF-α和CXCL1的mRNA表达水平在溶剂对照组和IL-6阻断组中均高于正常对照组，差异均有统计学意义（P＜0．05）；而溶剂对照组和IL-6阻断组的差异均无统计学意义。见图5。

3　讨论

IL-6信号活化存在经典途径和间接途径两种方式。经典途径即IL-6先与膜结合型受体IL-6R结合，而后与gp130二聚体作用将信号转导到胞内；间接途径即IL-6先与可溶型受体sIL-6R结合，再与细胞膜上的gp130二聚体作用将信号转导到胞内［9］。间接途径使IL-6的靶细胞不再局限于细胞膜上同时表达IL-6R和gp130二聚体的细胞，而是所有细胞膜上表达gp130二聚体的细胞都成为其潜在靶细胞［10］。IL-6具多种生物学功能，可诱导急性期反应蛋白表达、T细胞激活和B细胞的分化，因此在炎症性疾病发生发展中起重要作用［11］。此外，IL-6参与多条促进肿瘤细胞增殖、转移和血管生成等的信号通路［12］。因此阻断IL-6信号通路成为治疗相关疾病的重要策略，IL-6R的单克隆抗体塔西抗体已作为治疗类风湿性关节炎、卡斯特莱曼病和全身型关节炎的药物应用于临床，并有可能通过进一步研究用于治疗更多其它的自身免疫性疾病和慢性炎症性疾病［13］。本研究所用的重组蛋白m IL-6RFP基因序列长度为2 088 bp、分子量为94 ku，由gp130配体结合域、IL-6R配体结合域和HisTag标签三部分组成［14］。重组蛋白m IL-6RFP是一种IL-6拮抗剂，在其IL-6R配体结合域能和gp130配体结合域共同作用下可阻断IL-6与受体的结合，从而抑制IL-6的生物效应［8］。

本次细胞实验所用HepG2细胞表达IL-6R，用IL-6刺激后FGG和HP的mRNA水平呈现高表达［7］，实验中m IL-6RFP通过与IL-6R竞争性结合IL-6，抑制IL-6生物效应，表明获得的m IL-6RFP是一种有生物学活性的蛋白，为进一步研究IL-6在相关疾病模型中的作用提供了有用的材料。虽然IL-6 在C57BL／6小鼠日本血吸虫感染模型中表达显著升高，但IL-6在此模型中所起的作用尚不清楚［4］。本研究的动物实验结果显示m IL-6RFP不能使IL-6阻断组小鼠肝脏肉芽肿病变发生明显改变，由此推测其它因素在起作用。在IL-6阻断组小鼠肝脏中IL-1β、IL-13、TNF-α和CXCL1的mRNA水平均显著升高，这与这些炎症性细胞因子和趋化因子在肉芽肿形成和发展中起重要作用的报道［3-4］相符。该结果部分解释了IL-6在BALB／c小鼠日本血吸虫感染模型肝脏肉芽肿形成中不起主要作用，IL-1β、IL-13、TNF-α和CXCL1在本动物模型中是更强的致炎因素。而IL-17在C57BL／6小鼠日本血吸虫感染模型肉芽肿形成过程中发挥重要作用，采用IL-17中和抗体阻断IL-17后肝脏肉芽肿病变显著减轻［4］，并且IL-6在Th17细胞的分化过程中发挥一定的作用［12］。但该研究中动物实验结果显示BALB／c小鼠的IL-17 mRNA水平在溶剂对照组和IL-6阻断组中表达量均未升高，与C57BL／6小鼠日本血吸虫感染模型结果不同，这可能与两种品系小鼠免疫系统反应差异有关。

研究［5］报道在大鼠败血症模型中，肝细胞受到损伤后ALT和AST显著增高，同时发现IL-6的mRNA水平和蛋白水平也明显增高，采用抑制剂（EX527）可阻断IL-6的生物效应，即抑制了IL-6对肝功能指标ALT和AST活性的影响。本次动物实验肝功能指标检测结果显示ALT和AST在IL-6阻断组比溶剂对照组显著下降，因为m IL-6RFP在小鼠体内能结合IL-6并阻断其生物效应，从而抑制IL-6对肝细胞酶活性的影响，显示了其可改善肝功能指标的作用。

参考文献

［1］Ross A G，Olvedab R M，Acosta L，etal．Road to the elimination of schistosomiasis from Asia：the journey is far from over［J］．Microbes Infect，2013，15（13）：858-65．

［2］Chuah C，JonesM K，BurkeM L，etal．Cellularand chemokinemediated regulation in schistosome-induced hepatic pathology［J］．Trends Parasitol，2014，30（3）：141-50．

［3］Li X，Shen J，Zhong Z，et al．Paeoniflorin ameliorates schistosomiasis liver fibrosis through regulating IL-13 and its signallingmolecules in mice［J］．Parasitology，2010，137（8）：1213-25．

［4］Zhang Y，Chen L，GaoW，etal．IL-17 neutralization significantly ameliorates hepatic granulomatous inflammation and liver damage in Schistosoma japonicum infected mice［J］．Eur J Immunol，2012，42（6）：1523-35．

［5］Ding Y，Lin Y，Zhu T，et al．Interleukin 6 increases dysfunction of organs in sepsis rats through sirtuin 1［J］．Int JClin Exp Med，2014，7（9）：2593-8．

［6］Murakami M，Hirano T．The pathological and physiological roles of IL-6 amplifier activation［J］．Int JBiol Sci，2012，8（9）：1267 -80．

［7］Brock M，Trenkmann M，Gay R E，et al．MicroRNA-18a enhances the interleukin-6-mediated production of the acute-phase proteins fibrinogen and haptoglobin in human hepatocytes［J］．J Biol Chem，2011，286（46）：40142-50．

［8］Metz S，Wiesinger M，VogtM，etal．Characterization of the interleukin（IL）-6 inhibitor IL-6-RFP：fused receptor domains act as high affinity cytokine-binding proteins［J］．J Biol Chem，2007，282（2）：1238-48．

［9］Jones SA，Scheller J，Rose-John S．Therapeutic strategies for the clinical blockade of IL-6／gp130 signaling［J］．J Clin Invest，2011，121（9）：3375-83．

［10］Garbers C，Hermanns H M，Schaper F，etal．Plasticity and crosstalk of interleukin 6-type cytokines［J］．Cytokine Growth Factor Rev，2012，23（3）：85-97．

［11］Garbers C，Aparicio-Siegmund S，Rose-John S．The IL-6／gp130／STAT3 signaling axis：recent advances towards specific inhibition ［J］．Curr Opin Immunol，2015，34C：75-82．

［12］Maddur M S，Miossec P，Kaveri SV，et al．Th17 cells：biology，pathogenesis of autoimmune and inflammatory diseases，and therapeutic strategies［J］．Am JPathol，2012，181（1）：8-18．

［13］Tanaka T，Kishimoto T．Targeting interleukin-6：all the way to treat autoimmune and inflammatory diseases［J］．Int JBiol Sci，2012，8（9）：1227-36．

［14］程海燕，高闻达，任翠平，等．鼠IL-6受体融合蛋白的表达及初步鉴定［J］．安徽医科大学学报，2014，49（8）：1088-91．

IL-6RFP can protect liver function in themodel ofm ice infected w ith Schistosoma japonicum

Ping Chunguang1，Cheng Haiyan1，Gao Wenda2，etal
（1Dept of Microbiology and Parasitology，Anhui Medical University，Hefei230032；2Antagen Pharmaceuticals，Inc．，Boston02118）

AbstractObjectiveTo explore the role ofmouse interleukin-6 receptor fusion protein（m IL-6RFP）for the protection of liver cells in themodel of BALB／cmice infected with Schistosoma japonicum．MethodsNickel ion column was used to obtain purified recombinantm IL-6RFP protein．In vitro，HepG2 cellswere used to verify the biological activity ofm IL-6RFP．BALB／c mice were administrated by tail vein injection with 100μg ofm IL-6RFP or equal volume solvent，at24，26，28，30，32，34，36，38，and 40 days after infection．Mice were sacrificed 48 h after the last injection．The granuloma size wasmeasured in themouse liver by HE staining．Interleukin-1β（IL-1β），interleukin-13（IL-13），tumor necrosis factor-α（TNF-α）and chemokine（C-X-C motif）ligand 1 （CXCL1）mRNA levels in mouse liver tissue were detected by RT-PCR．Alanine aminotransferase（ALT）and aspartate transaminase（AST）were measured by the continuousmonitoring method．Resu ltsHepG2 cells experiments showed thatm IL-6RFP could reduce the effectof IL-6 on HepG2 cells，fibrinogen（FGG）and haptoglobin （HP）was significantly reduced（P＜0．05）．In the BALB／c mice infected with Schistosoma japonicum，when IL-6 wasblocked the levelsof ALT and AST were decreased significantly（P＜0．05）compared with thatof the solvent group，while there was no significant difference on granuloma formation．ConclusionIn the BALB／c mice infected with Schistosoma japonicum，m IL-6RFP can significantly improve the liver function but no obvious effect on granuloma formation．

Key wordsIL-6；Schistosoma japonicum；BALB／c mice

中图分类号R 383．24；R 392．3

文献标志码A

文章编号1000-1492（2015）11-1538-05

基金项目：国家自然科学基金（编号：30972569、81471982）

作者单位：1安徽医科大学病原生物学教研室，合肥230032

作者简介：平春光，男，硕士研究生；