m iR-483-5p通过靶基因ERK1调控人类颗粒细胞增殖凋亡平衡

蒋秀敏，刘雨生，许　波

m iR-483-5p通过靶基因ERK1调控人类颗粒细胞增殖凋亡平衡

蒋秀敏，刘雨生，许波

摘要目的证明miR-483-5p及其靶基因ERK1参与调控人类颗粒细胞增殖凋亡平衡。方法①体外培养人正常颗粒细胞，调控其miR-483-5p超表达，聚合酶链反应（PCR）及Western blot法检测ERK1的mRNA及蛋白表达情况；将包含野生型或突变型的ERK1 mRNA 3′UTR的DNA片段克隆在荧光素酶标记的质粒，共转染miR-483-5p mimics、controlmiRmimics和野生型、突变型重组质粒，检测其颗粒细胞相对荧光素酶活性；②将miR-483-5p mimics及ERK1 siRNAs单独及共同转染颗粒细胞，MTT法及TUNEL法分别检测三种情况下卵巢颗粒细胞的增殖、凋亡情况。结果①miR-483-5p超表达后，ERK1基因及蛋白表达均下降；与control-Wt（野生型）转染组相比，miR-483-Wt组的荧光素酶活性显著降低；miR-483-Mut（突变型）与control-Mut转染组间荧光素酶活性的比较差异无统计学意义；②miR-483-5p mimics与ERK1 siRNAs单独及共同转染颗粒细胞，三种转染条件下颗粒细胞增殖均显著受抑制、凋亡率显著升高，且三种作用效果差异无统计学意义。结论miR-483-5p通过直接与靶基因ERK1结合，参与调控人类颗粒细胞增殖凋亡平衡。

关键词miR-483-5p；ERK1／2-MAPK通路；颗粒细胞；增殖凋亡平衡

2015-07-27接收

刘雨生，男，主任医师，博士生导师，责任作者，E-mail：shengzhizhongxin＠126．com

微小RNA（microRNA，miRNA）作为基因表达的负调控因子，参与了包括分化、增殖、凋亡等过程，进而参与包括胚胎发育、肿瘤发生、压力应答等几乎所有的生物学进程［1］。miRNA广泛参与卵泡发育成熟、受精、着床及早期胚胎发育等过程，维持女性正常生育功能［2-4］。颗粒细胞是卵巢中十分重要的细胞，参与了包括原始卵泡生长启动、增殖、分化、闭锁、排卵等全部的卵巢生理过程，与卵巢疾病的发生密切相关［4］。如果颗粒细胞发生大量凋亡，将引起卵泡内局部激素环境变化，进而干扰正常卵泡发育，导致卵巢病理性改变，如多囊卵巢综合症（polycystic ovarian syndrome，PCOS）的发生等［5-6］。因此颗粒细胞的增殖-凋亡平衡对生殖功能产生重要的影响。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）家族中关键通路ERK1／2-MAPK信号转导通路在调控卵巢内颗粒细胞增殖、凋亡、分化中的作用已引起了广泛关注。研究［1］表明，ERK1／2-MAPK通路参与维持卵巢内颗粒细胞增殖-凋亡的平衡。另有研究［7］表明miR-483-5p在肿瘤中的作用较多，体内外实验显示其与癌细胞的增殖、凋亡、细胞周期变化及其迁移、侵袭能力等生物学行为有关；有研究者证明miR-483-5p通过直接调控靶基因血清反应因子（serum response factor，SRF）发挥抑制血管形成的作用［8］。笔者在前期研究［2］中发现，通过比较PCOS和正常人群颗粒细胞内差异表达的miRNA及其下游通路，发现miR-483-5p在PCOS颗粒细胞中表达明显升高且ERK1的表达明显下降，并证实颗粒细胞内ERK1的表达变化受到了 miR-483-5p的调控。该研究通过单独、共同转染miR-483-5p及siRNAs颗粒细胞后，观察颗粒细胞的增殖凋亡情况。

1　材料与方法

1．1研究对象卵巢颗粒细胞均来自于安徽医科大学附属省立医院生殖医学中心，选取的是因男方因素行自然周期单精子卵胞浆内注射与胚胎移植（Intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer，ICSI-ET）而助孕的女方颗粒细胞。按照安徽医科大学附属省立医院伦理委员会规定，入选患者签署知情同意书。

自然周期选取标准：①所有研究对象无全身及其它妇科、内分泌等疾病；②月经规律；③超声检查无多囊卵巢改变；④基础内分泌无异常；⑤排除糖尿病家族史，空腹血糖水平正常；⑥男方均为重度少弱精症或梗阻性无精症；⑦男女双方无染色体异常；⑧研究对象的年龄均在25～33岁。

1．2主要试剂RPMI-1640（美国Gibco公司）；miR-483-5pmimics、control-miRmimics（Gene Pharma 公 司）；LipofectamineTM2000（Invitrogen公司）；HMA F10（英国 Sigma公司）；SYBR premix Ex TaqTMIIKit（TaKaRa公司）；硝酸纤维素膜（Amersham Biosciences）；抗-ERK1抗体、β-actin抗体（Abcam公司）；羊抗兔IgG抗体（Promega公司）；MTT溶液、DMSO、TUNEL反应混合液（Roche公司）。

1．3方法

1．3．1颗粒细胞的分离及培养自然周期阴道穿刺取卵；获取的含有成熟卵母细胞的卵丘复合物经机械切割法分离外围颗粒细胞。用含有20%胎牛血清的RPMI-1640培养液培养。于37℃、含5%CO2培养箱内原代培养24 h。取对数生长期细胞用于实验。

1．3．2miRNA及siRNAs转染至颗粒细胞将miR-483-5pmimics及ERK1 siRNAs单独及共同转染至颗粒细胞。将miR-483-5p mimics和 controlmiR mimics分别加入无血清无双抗培养基EP管中，均匀混合，缓慢加入含2μl LipofectamineTM2000 50μl无血清无双抗HMA F10培养基中，反复颠倒混匀，在室温下以使脂质体与类似物或对照形成复合物，在37℃、5%CO2的培养箱中孵育。转染miR-483-5p mimics组标记为转染组，转染controlmiR mimics组标记为对照组。miR-483-5p mimics序列为：5′-AAGACGGGAGGAAAGAAGGGAG-3′；control-miRmimics序列为：5′-UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUA-3′。

通过聚合酶链反应（PCR）法分别检测转染组和对照组中的靶基因ERK1 mRNA表达量，通过Western blot分析两组在转染后ERK1蛋白的表达情况，同时检测两组的颗粒细胞增殖率及凋亡率。转染siRNAs与转染miRNA步骤一样。

1．3．3荧光素酶报告基因的构建和荧光素酶活性检测将miRNA的靶基因mRNA的3′UTR克隆到荧光素酶报告载体上，荧光素酶报告系统能够显示miRNA是否直接结合到这个UTR上。由上海康成生物工程有限公司完成野生型和突变型ERK1 mRNA 3′UTR荧光素酶报告基因质粒的构建和鉴定。取对数生长期的卵丘颗粒细胞，参照脂质体LipofectamineTM2000说明书的操作步骤进行，将 miR-483-5p mimics和control-miR mimics及野生型和突变型ERK1 mRNA 3′UTR共转染到颗粒细胞中。按双荧光素酶检测试剂盒检测方法进行，在细胞转染24 h后，加入细胞裂解液和萤火虫荧光素酶检测剂100μl，混匀15 min后，检测萤火虫荧光素酶活性（Ff），再加入海肾素荧光素酶检测试剂100μl，测量海肾素荧光素酶活性（Rn）。荧光素酶活性（C）＝Rn／Ff。

1．3．4miRNA及 mRNA表达的检测分别检测三种情况下ERK1 mRNA表达量。提取卵丘颗粒细胞总RNA后，首先利用Reverse Transcription Kit对总RNA内待检测的miR-483-5p进行反转录，然后利用SYBR premix Ex TaqTMIIKit检测miRNA的表达水平，所有步骤均严格按照操作手册进行。其中snRNAU6作为miRNA表达量检测时的内参，GAPDH作为mRNA的内参。每个样品的PCR反应平行重复3个孔，所有RT-PCR实验独立重复3次。根据待测基因和内参的循环数CT值，按照公式：相对值＝2-ΔΔCT计算出样本待测基因相对于内参基因的相对表达量。

1．3．5Western blot分析颗粒细胞中加入RIPA裂解液裂解细胞，提取上清总蛋白。蛋白经12% SDS-PAGE 120V电泳，再转移至硝酸纤维素膜上。转膜后用5%脱脂牛奶／TBST封闭1 h，然后4℃冰箱中封闭过夜。分别加入抗-ERK1抗体及作为内参的β-actin抗体。然后加入二抗，即用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体，孵育2 h，用TBST洗膜30 min。将洗好的硝酸纤维素膜放入透明的薄膜中，并在其上加入显色液后，待反应一段时间后，观察显色效果。出现合适亮度条带后用定影液对其进行定影，再清洗后晾干，最后扫描或者拍照保存。

1．3．6MTT法检测细胞增殖能力选取颗粒细胞，用胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，经细胞计数后调整细胞密度至5×104个／ml，然后接种至96孔板，每孔200μl，放入CO2恒温培养箱中培养3～5 d，每孔加入MTT溶液20μl继续孵育4 h，小心吸去上清液，每孔加 150μl的DMSO，然后将 96孔板放在摇床上匀速摇晃10 min，分别在24、48、72 h检测492 nm处各孔吸光度，计算其细胞增殖率。

1．3．7TUNEL检测细胞凋亡颗粒细胞接种在预置有灭菌玻片的24孔培养板中，细胞计数控制密度在5×104／m l，用含10%热灭活胎牛血清、1%青链霉素的DMEM培养液中，将爬片擦干后放置于湿盒上，用TBS1～100新鲜稀释的蛋白酶K室温下处理30 min，处理组加入TUNEL反应混合液（50μl TdT和450μl荧光素标记的dUTP液混匀），以50μl／片的量滴入爬片；而阴性对照组滴入50μl荧光素标记的dUTP；阳性对照组滴入50μl DNasel缓冲液，用甘油封片，在荧光显微镜下观察凋亡细胞。结果判定：每个样本随机观察20个视野，分别对凋亡细胞数和总细胞进行计数，并计算调亡率。分别在转染后的24、48、72 h检测颗粒细胞凋亡率。

1．4统计学处理采用SPSS 17．0统计软件进行分析，数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析。

2　结果

2.1证实m iRNA-483-5p调控 ERK 1的表达通过miRNA-483-5p mimics转染颗粒细胞，检测miRNA-483-5p超表达后的ERK1 mRNA和蛋白的表达水平。PCR和Western blot结果显示，miRNA-483-5p转染颗粒细胞后ERK1 mRNA和蛋白表达均下降，见图1A、1B。进一步将包含野生型或突变型的ERK1 mRNA 3′UTR的DNA片段克隆在荧光素酶标记的质粒，共转染了miR-483-5p mimics、controlmiRmimics和野生型／突变型重组质粒，检测其颗粒细胞相对荧光素酶活性，与control-Wt转染组相比，miR-483-W t组的荧光素酶活性显著降低；miR-483-Mut与control-Mut转染组间荧光素酶活性的比较差异无统计学意义，见图1C、1D。

2.2过表达 m iR-483-5p及 ERK1 siRNAs对颗粒细胞体外增殖影响在颗粒细胞单独转染miR-483-5pmimics及ERK1 siRNAs的24、48、72 h，MTT法分别检测不同时间细胞的增殖率，与对照组相比，单独转染miR-483-5p mimics及ERK1 siRNAs均明显抑制颗粒细胞的增殖率（P＜0．05），见图2A、2B，且随着时间延长其抑制越明显。

2.3TUNEL染色检测转染m iR-483-5p m im ics及ERK1 siRNAs后颗粒细胞的凋亡情况与对照组相比，两组的凋亡率明显升高，同时随着时间延长其凋亡率越高，见图3、表1。

表1　转染m iR-483-5p m im ics及ERK 1 siRNAs后颗粒细胞的凋亡率（%）

2.4单独及共同转染m iR-483-5p与ERK1 siRNAs对颗粒细胞增殖凋亡平衡的影响MTT法检测结果显示，与对照组比较，转染miR-483-5p、转染ERK1 siRNAs及共同转染miR-483-5p和ERK1 siR-NAs均明显抑制颗粒细胞的增殖率，且三组之间差异无统计学意义（F＝31．76，P＜0．05），图4A；TUNEL法检测三组颗粒细胞的凋亡率均明显升高，见图4B，且三组之间差异无统计学意义（F＝315．58，P＜0．05）。

3　讨论

miRNA是一种内源性的非编码小RNA（18～25个核苷酸）通过降解靶mRNA或抑制其翻译，对基因进行转录后水平的调控。在前期研究中，通过绘制的人类卵丘颗粒细胞差异表达miRNA图谱发现，颗粒细胞内miRNA通过调控能量／氨基酸代谢、免疫调节、激素调控、细胞分化等多个通路，参与了卵母细胞和卵泡的发生与发育［4］。进一步通过分析PCOS患者和正常对照人群颗粒细胞内差异表达的miRNA及下游通路，发现miR-483-5p在PCOS颗粒细胞中表达明显升高，且通过调节靶基因ERK1 （MAPK3）表达参与下游MAPK信号通路的调控［2］。本研究结果表明miR-483-5p能下调ERK1在卵巢颗粒细胞中的表达。在此基础上利用双荧光素酶报告系统结合miRNA-mRNA结合位点突变等方法进一步确认miR-483-5p对于靶基因ERK1表达的抑制是通过直接结合而抑制的。

颗粒细胞具有分泌性腺激素维持卵巢功能的能力，在卵泡的正常发育中起着重要的作用。在需要进行辅助生殖的人群中发现，颗粒细胞凋亡直接影响IVF-ET的结局与妊娠成功率［9］。这些证据表明颗粒细胞的增殖-凋亡平衡对于卵巢内的激素微环境、卵子和卵子的发育及后期胚胎的形成和生长都具有极其重要的影响。Amhr2-cre-Dicer1条件性敲除小鼠模型的研究［10］表明miRNA在卵巢体细胞中的缺失会导致原始卵泡形成增多、早期卵泡激活加速以及闭锁卵泡增多等多种表型，与卵泡发育相关基因等也同时发生了显著性的变化。本研究中通过人为调控对miR-483-5p进行超表达，结果表明超表达后颗粒细胞增殖受抑制，凋亡率增加。这些结果表明卵巢颗粒细胞内的miRNA对于卵母细胞、卵泡的生长发育有着不可替代的调控作用［1-4］。

ERK1／2-MAPK通路是细胞表面信号传导至细胞核的重要传递者，通过影响基因的转录和表达进而影响细胞的增殖、分化、凋亡、转化等关键过程［11-12］。颗粒细胞ERK1／2-MAPK通路在促卵泡刺激素（FSH）及生长因子介导的颗粒细胞增殖过程中发挥重要作用，并且ERK1／2-MAPK通路的持续激活可以阻止细胞凋亡的发生［11-12］。利用ERK1／2特异性抑制剂U0126抑制ERK1／2的活性会抑制FSH对颗粒细胞增殖的促进作用，并且抑制颗粒细胞内激素的正常分泌［13］。有研究［14］显示，卵巢内颗粒细胞的异常状态与MAPK通路的失调直接相关。在颗粒细胞内，ERK1／2的激活导致下游丝氨酸／苏氨酸激酶P90RSK蛋白、转录因子-3 （Stat3）等磷酸化而激活转录，从而促进细胞生长和增殖。同时，活化后的ERK1可以促进细胞周期素D1（CylinD1）与细胞周期蛋白依赖性激酶-4 （CDK4）的结合进而调控细胞周期［1］。这些证据表明，ERK1／2-MAPK通路参与维持卵巢内颗粒细胞增殖-凋亡的平衡。前期研究［2］显示，PCOS患者颗粒细胞内ERK1的表达和对照组相比出现明显的下降，并证实颗粒细胞内 ERK1的表达变化受到了miR-483-5p的调控。与之相对应的，本研究显示miR-483-5p mimics转染和ERK1 siRNAs单独及两者共同处理颗粒细胞后，检测ERK1／2-MAPK通路关键分子的表达和活性，结果显示颗粒细胞的增殖能力明显下降，而凋亡比例明显升高，且不论单独及共同处理其作用差异无统计学意义，这表明miR-483-5p下调ERK1表达参与颗粒细胞增殖凋亡平衡与ERK1 siRNAs的转染抑制ERK1表达参与颗粒细胞增殖凋亡机制在一条通路上。这些结果进一步证实miR-483-5p直接调控ERK1，参与调控卵巢内颗粒细胞增殖、凋亡等关键过程。

维持颗粒细胞增殖-凋亡平衡是正常卵泡发育的必要条件，该平衡的失调对于卵巢内的激素微环境、卵子和卵子的发育及后期胚胎的形成和生长都具有极其重要的影响。同时颗粒细胞增殖与凋亡平衡的维持是一个多因素调控的复杂过程，miRNA、mRNA、蛋白质构成了复杂而精密的调控网络。平衡一旦被打破，卵巢功能就会出现异常，不但会导致生殖功能异常，同时还会引起代谢失调等其他并发症。因此，了解miR-483-5p及其下游靶基因和通路在维持颗粒细胞增殖-凋亡平衡中的作用，将为研究卵巢、卵泡、卵子的发育和调控以及相关疾病研究提供新的思路和研究手段，有助于了解miRNA在雌性生殖细胞发育及相关生殖过程中的作用。

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Characterization ofm iRNA-483-5p and targeted gene ERK1 in the regulation of proliferation-apoptosis balance of human granulosa cells

Jiang Xiumin，Liu Yusheng，Xu bo
（Reproductive Medicine Center，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei230001）

AbstractObjectiveTo demonstrate thatmiR-483-5p and its targeted gene ERK1 involved in the regulation of proliferation and apoptosis of human granulosa cells．Methods①The ERK1 mRNA and protein level expression were detected by PCR and Western blot aftermiR-483-5p overexpression in vitro normal human granular cells．Detected the relative luciferase density after cotransfectingmiR-483-5p mimics and its control respectively with wild or mutant ERK1 mRNA 3｀UTR cloned luciferase report vector in granular cells．②Granular cells proliferation and apoptosis were detected by MTT and TUNEL after transfectingmiR-483-5p mimics or ERK1 siRNAs alone or simultaneously．Results①It showed thatboth ERK1 mRNA and protein in granular cellsweremarkedly downregulated after the transfection ofmiR-483-5pmimics．A significant relative luciferase activity decrease were detected in the granular cells co-transfected with ERK1 wild and miR-483-5p mimics comparison with the controlmimics，but not in the cells co-transfected with the ERK1 mutant andmiR-483-5pmimics．②WhenmiR-483-5p mimicsand ERK1 siRNAs were alone or co-transfected into granular cells，the proliferation was inhibited while apoptosis trend was monitored to be promoted in all cases．No obvious statistic difference was shown between each other．Conclusion MiR-483-5p is involved in the regulation of the proliferation and apoptosis of human granulosa cells by directly binding to the target gene ERK1．

Key wordsmiR-483-5p；ERK1／2-MAPK pathway；granular cells；proliferation-apoptosis balance

中图分类号R 715．5；R 329．5

文献标志码A

文章编号1000-1492（2015）11-1639-06

基金项目：国家自然科学基金（编号：81370757）

作者单位：安徽医科大学附属省立医院生殖中心，合肥230001

作者简介：蒋秀敏，女，硕士研究生；