阿司匹林抵抗患者的基因多态性研究

孙洲亮，贾俊婷，肖惠玲

(厦门大学附属第一医院 药学部，福建 厦门 361003)



阿司匹林抵抗患者的基因多态性研究

孙洲亮Δ，贾俊婷，肖惠玲

(厦门大学附属第一医院 药学部，福建 厦门 361003)

目的 探究阿司匹林抵抗患者COX-1、P2Y1、GPIa及GPIIIa基因多态性。方法 收集动脉粥样硬化阿司匹林抵抗患者35例，患者予以阿司匹林肠溶片口服治疗，14天后测定每位患者COX-1、P2Y1、GPIa及GPIIIa基因多态性进行对比分析。结果 COX1(A-842G)位点基因型为AA及COX1(C50T)位点基因型为CC检测比例较高，与其他基因比较差异具有统计学意义(P<0.05)；P2Y1(A1622G)位点基因型为AG；P2Y1(C893T)位点基因型为CC检测比例较高，与其他基因比较差异具有统计学意义(P<0.05)；GPIa(C807T)位点基因型为CT；GPIa(G873A)位点基因型为GA检测比例较高，与其他基因比较差异具有统计学意义(P<0.05)；GPⅢa(T1565C)位点基因型为TT比例较高，与其他基因比较差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 P2Y1 (C893T)、GPIa(C807T) 等位基因与阿司匹林抵抗具有相关性，与COX-1(A-842G、C50T)、GPIa(G873A)、GPⅢa(T1565C)、P2Y1(A1622G)等位基因相比更易诱导阿司匹林抵抗的发生。

COX-1；P2Y1；GPIa；GPIIIa；基因多态性；阿司匹林抵抗；相关性

阿司匹林是一种在心脑血管病防治中起关键作用的抗血小板聚集药，可有效抑制血小板活化以及聚集，预防血栓形成，血小板活化和聚集在动脉粥样硬化血栓形成的发病机制中起着关键作用，也是导致急性冠状动脉(冠脉)综合征(ACS)的直接原因，临床常用于心脑血管病的一级和二级防治[1]。阿司匹林已被广泛应用于心脑血管病患者及其高危人群，多项循证医学证实长期口服阿司匹林可减少心血管事件，然而阿司匹林抗血小板作用具有个体差异性，部分患者由于长期服用，存在阿司匹林抵抗(aspirin resistance，AR)，其心脑血管病的发生率以及病死率并未降低，其发生机制不明确[2]。因此人群中慢性疾病遗传机制和药物治疗的有效性研究是当今医学领域的重点课题，尤其是基因多态性与阿司匹林抵抗的相关性。现代研究表明，COX-1、P2Y1、GPIa及GPIIIa等的基因多态性与阿司匹林抵抗密切相关。本研究拟通过检测动脉粥样硬化高危中国汉族人群中环氧化酶-1 (COX-1)(A-842G、C50T)、血小板膜糖蛋白GPIa(C807T、G873A)、血小板膜糖蛋白GPⅢa(T1565C)和5-二磷酸腺苷受体P2Y1(A1622G、C893T)多态性的基因频率分布及其与阿司匹林抵抗的相关性，旨在为心脑血管疾病患者抗血小板聚集的个体化治疗方案提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2014年7月～2015年8月厦门大学附属第一医院心内科、高干科收治动脉粥样硬化阿司匹林抵抗患者35例，男性20例，女性15例，年龄45～78岁，平均年龄(61.31±8.24)岁，患者的一般情况相仿，差异无统计学意义，具有可比性。

纳入标准[3]：所有患者均符合以下条件：①诊断符合阿司匹林抵抗判定标准具备以下临床特点：AA诱导的血小板聚集率≧20% ；ADP诱导的血小板聚集率≧70%；②汉族，年龄20-80岁，患者病情控制稳定，能配合实验；③因动脉粥样硬化服用阿司匹林(100 mg/d)至少14 d以上；④患者均为自愿参与本实验，有完善的就诊资料，并签署知情同意书。本实验获得本院伦理委员会批准。

排除标准：①药物过敏史，接受免疫抑制剂或低分子肝素抗凝药物治疗的患者，服用影响血小板功能类药物，阿司匹林过敏，出血倾向，血液疾病血小板计数>400×109/L或<100×109/L，血红蛋白>169或<100 g/L，消化性溃疡病史；②急慢性感染性疾病以及严重心、肝、肾等多脏器功能障碍或衰竭；③恶性肿瘤、癫痫等神经系统疾病。

剔除标准：①患者住院期间或出院后无法规律服用或未按时服用阿司匹林抗血小板治疗；②服药期间抽烟、饮酒；③更改阿司匹林规格服用。

脱落、中止试验标准：①患者在实验期间出现严重的不良事件；②患者在实验过程中出现严重的合并疾病；③受试者依从性较差差(试验用药依从性低于80%或超过120%)或期间应用除本方案外的其他禁止使用的中西药，更换换药或使用其他药物者。

1.2 方法

1.2.1 试验用药：患者均持续服用拜阿司匹林肠溶片(上海海虹实业(集团)巢湖今辰药业有限公司，国药准字H34021119)，口服100 mg/片；1次/天，持续服药≥14天。

1.2.2 观察指标：采取清晨空腹肘部静脉血5 mL，不抗凝，静置后以2000 r/min离心20 min，分离血清置于-20 ℃冰箱保存待测，严格按照试剂盒以及仪器说明书步骤操作，检测血清葡萄

糖、血常规、LDL、HDL、甘油三酯等临床指标；另一管标本用于提取DNA，通过焦磷酸测序法测定COX-1(A-842G、C50T)、GPIa(C807T、 G873A)、GPⅢa(T1565C)、P2Y1(A1622G、C893T)等位点的基因多态性。

2 结果

2.1 COX1基因多态性检测结果 COX1(A-842G)位点基因型为AA及COX1(C50T)位点基因型为CC检测比例高于其他可见基因型(P<0.05)。见表1。COX1(A-842G)目标基因位点野生型标准序列：GCTGGACACTG(下划线为多态位点野生型位点)；突变型序列：GCTGGGCACTG(下划线为突变型位点)；检测结果序列： GCTGGACACTG(结果为野生型，见图1下划线)。COX1(C50T)目标基因位点野生型标准序列：GCTCCCGCCGC(下划线为野生型位点)；突变型序列：GCTCCTGCCGC(下划线为突变型位点)；检测结果序列： GCTCCCGCCGC(结果为野生型，见图2下划线序列)。

表1 COX1中可见基因所占比例(n，%)Tab.1 Proportion of visible genes in COX1(n，%)

*P<0.05，与AA基因型比较，compared with the AA genotype；#P<0.05，与CC基因型比较，compared with with the CC genotype

图1 COX1(A-842G)(正测)Fig.1 COX1(A-842G)(positive test)

图2 COX1(C50T)(正测)Fig.2 COX1(C50T)(positive test)

2.2 P2Y1基因多态性检测结果 P2Y1(A1622G)位点基因型为AG及P2Y1(C893T)位点基因型为CC检测比例高于其他基因(P<0.05)。见表2。P2Y1(A1622G)目标基因位点野生型标准序列：CTGGTAATCAT(下划线为野生型位点)；突变型序列：CTGGTGATCAT(下划线为突变型位点)；检测结果序列：CTGGTA/GATCAT(结果为突变杂合子，见图3下划线)。P2Y1(C893T)目标基因位点野生型标准序列：CTGGCCGGTCC(下划线为多态位点野生型位点)；突变型序列：CTGGCTGGTCC(下划线为多态位点突变型位点)。检测结果序列：CTGGCCGGTCC(结果为野生型，见图4下划线)。

表2 P2Y1中可见基因所占比例(n，%)Tab.2 Proportion of visible genes in P2Y1(n，%)

*P<0.05，与AG基因型比较，compared with the AG genotype；#P<0.05，与CC基因型比较，compared with CC genotype

图3 P2Y1(A1622G)(正测)Fig.3 P2Y1(A1622G)(positive test)

图4 P2Y1(C893T)(正测)Fig.4 P2Y1(C893T)(positive test)

2.3 GPIa基因多态性检测结果 GPIa(C807T)位点基因型为CT及GPIa(G873A)位点基因型为GA检测比例高于其他基因型(P<0.05)。见表3。GPIa(C807T)目标基因位点野生型标准序列：ACATTCGGAGC(下划线为野生型位点)；突变型序列：ACATTTGGAGC(下划线为突变型位点)。检测结果序列： ACATTC/TGGAGC(结果为突变杂合子，见图5下划线序列)。GPIa(G873A)目标基因位点野生型标准序列：ACATTCGGAGC(下划线为野生型位点)；突变型序列：ACATTTGGAGC(下划线为突变型位点)。结果序列： ACATTC/TGGAGC(结果为突变杂合子，见图6下划线序列)。

表3 GPIa中可见基因所占比例(n，%)Tab.3 Proportion of visible genes in GPIa(n，%)

*P<0.05，与CT基因型比较，compared with the CT genotype；#P<0.05，与GA基因型比较，compared with GA genotype

图5 GPIa(C807T)(正测)Fig.5 GPIa(C807T)(positive test)

图6 GPIa(G873A)(正测)Fig.6 GPIa(G873A)(positive test)

2.4 GPⅢa基因多态性检测结果 GPⅢa(T1565C)位点基因型为TT(32，91.43%)，高于其他基因型CC(2，5.71%)、TC(1，2.86%)(P<0.05)。目标基因位点野生型标准序列：GCCTCTGGGCT(下划线为野生型位点)；突变型序列：GCCTCCGGGCT(下划线为突变型位点)；结果序列： GCCTCTGGGCT(结果为野生型，见图7下划线序列)。

图7 GPⅢa(T1565C)(正测)Fig.7 GPⅢa(T1565C)(positive test)

3 讨论

心脑血管疾病已成为威胁国民健康的头号杀手，统计学显示，全世界每年死于心脑血管疾病的人数高达1500万人，居各种死因首位，我国每年死于心脑血管疾病近300万人[4]。阿司匹林作为一种有效的抗血小板聚集药物，用于缺血性心脏病、心绞痛、脑血栓形成以及心肺梗塞的等心脑血管疾病的防治，减少高危心肌梗死、心源性猝死以及脑卒中的发生率，医学界称之为“万灵药”[5]。临床观察显示阿司匹林作为脑梗死的预防和治疗药物被广泛应用，能减少约25%的心脑血管事件复发[6]。然而，并不是所有患者都能从阿司匹林治疗中获益，约有0.4%～83.3%的心脑血管患者对阿司匹林的抗血小板疗效不敏感，患者仍存在缺血性血管事件的发生，临床上将此类患者称为阿司匹林抵抗(aspirin resistance AR)[7]。阿司匹林抵抗广泛存在于正常健康机体、心脑血管疾病患者以及外周血管病患者中，发生率高达8%～45%，研究人员开始重视这一问题，因此，对阿司匹林抵抗人群的早期区分，可明显改善缺血性血管事件发生的危险性，具有良好的预防和治疗的作用。

阿司匹林抵抗的发生机制现代学者尚未研究清楚，猜测可能与阿司匹林使用剂量、患者对药物的依从性、血小管旁路激活途径以及基因多态性等多素因素具有相关性。基因多态性是从药物遗传多态性方面研究，表现为药物代谢酶、转运蛋白和作用靶点具有多态性。研究发现[8]，遗传可能是AR发生的重要因素，基因变异可能是患者对ASA敏感性以及特异性降低的主要原因。目前国内对于血小板活化路径及基因多态性的研究，结合阿司匹林抵抗人群，针对以下几个方面进行开展：血栓素激活途径中编码环氧合1(cycloxygenase1，COX1)的基因多态性；GPⅡb/Ⅲa激活途径中编码血小板膜GPⅢa的血小板抗1/血小板抗原2 (platelet antigen1/platelet antigen2，PLA1/PLA2)多态性；胶原激活途径中编码血小板膜GPⅠa/GPⅡa的807C/T和873G/A多态性；二磷酸腺苷(ADP)受体P2Y1的基因多态性。临床对于以上多态性位点对阿司匹林有抗血小板作用相关性早有猜测，但并未证实[9]。

COX是一种参与前列腺素合成的重要限速酶，有两种同工酶分别是COX-1以及COX-2，阿司匹林抵抗这两种酶，抑制前列腺素的分泌，其中COX-1丝氨酸530发生不可逆的乙酰化作用，使酶失活，抑制TXA2的生成，研究发现COX基因多态性具有多个位点。二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)是人类最早发现的诱导血小板聚集的重要物质，对血小板表面G蛋白与P2Y受体的连接进行调节，从而诱导两种血小板聚集的发生[10]。现代研究已发现8种P2Y受体亚型被克隆，达到进一步完善P2Y1以及P2Y12的研究的目的。ADP通过受体的突变与止血异常的作用，促进P2Y1和P2Y12受体刺激血小板的激活和聚集，受体的抑制作用诱导血小板聚集作用降低[11]。血小板膜糖蛋白Ia/IIa属于血小板质膜糖蛋白，其密度增加是诱发血栓形成以及多种心血管事件发生的潜在危险因素，影响患者阿司匹林抵抗[12]。 血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa是一种细胞黏附受体整合素，具有介导细胞以及外环境的跨膜受体，在血小板黏附以及聚集中将有关信息进行传导，参与血小板黏附和聚集，诱导血小板功能变性[12]。曾有学者猜测，AR与血小板膜GPⅡb/Ⅲa受体复合物的多态性具有紧密联系，GPⅡb/Ⅲa受体是血小板活化的最后共同通路[13]。GPⅡb/Ⅲa基因(包括编码GPⅡb和GPⅢa的基因)发生突变、缺失或插入等一系列生理病理改变，进而发生表型改变，导致血小板功能变性。国外学者经过研究发现，GPⅢa多态性有C157T、A1163C、A1553G以及T1565C等多个位点，其中外显子2第1565位氨基酸的突变临床最常见，即T1565C(Leu33Pro)，编码Leu的位点称为PLA1(HPA-1a)，编码Pro的位点称为PLA2(HPA-1b)。

本研究通过对我院收治35例动脉粥样硬化阿司匹林抵抗患者COX-1、P2Y1、GPIa及GPIIIa基因多态性进行研究，证实了P2Y1 (C893T)、GPIa(C807T) 等位基因与阿司匹林抵抗具有相关性，与COX-1(A-842G、C50T)、GPIa(G873A)、GPⅢa(T1565C)、P2Y1(A1622G)等位基因相比更易诱导阿司匹林抵抗的发生。

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(编校：谭玲)

Study on gene polymorphism in patients with aspirin resistance

SUN Zhou-liangΔ, JIA Jun-ting, XIAO Hui-ling

(Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of Xiamen University, Xiamen 361003, China)

ObjectiveTo explore the correlation between aspirin resistance and COX-1, P2Y1, GPIa and GPIIIa gene polymorphism.Methods35 case with aspirin resistant were selected and were given aspirin enteric coated tablets for oral treatment, 14 days. After the determination COX-1, P2Y1 and GPIa and GpIIIa gene polymorphism of each patient were analysis.ResultsThe genotype AA of COX1 (A-842G) locus and CC of COX1 (C50T) locus was higher than other genotype (P<0.05);AG of P2Y1 (A1622G) locus genotype and CC of P2Y1 (C893T) locus genotype was higher than other genotype (P<0.05);CT of GPIa (C807T) locus genotype and GA of GPIa (G873A) locus genotype was higher than other genotype (P<0.05);PLA1/A1 of GPⅢa(T1565C)locus genotype was higher than other genotype (P<0.05).ConclusionP2Y1 (C893T), GPIa (C807T) allele is associated with aspirin resistance,With COX-1 (A-842G, C50T), GPIa (G873A), GP III A (T1565C), P2Y1 (A1622G) allele is more likely to induce the occurrence of aspirin resistance.

COX-1; P2Y1; GPIa; GPIIIa; gene polymorphism; aspirin resistance; correlation

福建省卫计委中青年骨干项目(2014-ZQN-JC-41)

孙洲亮，通信作者，男，硕士，副教授、硕士生导师，研究方向：药物基因组学，E-mail:sunzhouliang@126.com。

R543

A

1005-1678(2015)12-0042-04