异荭草素对胃癌细胞自噬作用的研究

于海瑶，李石化，孙丽艳，张四喜，王贺雷Δ

(1.长春市食品药品检验中心，吉林 长春 130000；2.吉林大学第一医院药剂科，吉林 长春 130021)



异荭草素对胃癌细胞自噬作用的研究

于海瑶1，李石化1，孙丽艳1，张四喜2，王贺雷2Δ

(1.长春市食品药品检验中心，吉林 长春 130000；2.吉林大学第一医院药剂科，吉林 长春 130021)

目的 研究异荭草素对胃癌细胞自噬的作用。方法 MTT法检测异荭草素及自噬激活剂和抑制剂对胃癌SGC-7901细胞增殖的影响；流式细胞仪检测细胞凋亡的影响；吖啶橙(acridine orange，AO)、单丹磺酰戊二胺(monodansylcadaverin，MDC)染色了解胃癌SGC-7901细胞中自噬溶酶体的产生情况；Western blot检测自噬特征性蛋白的表达情况。结果 MTT结果提示异荭草素对胃癌SGC-7901细胞增殖具有抑制作用，同时自噬抑制剂能使3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)抑制细胞的凋亡，而自噬激活剂雷帕霉素(rapamycin，RAP)的作用相反。流式细胞仪检测细胞凋亡率时异荭草素及RAP能促进细胞凋亡，而3-MA作用相反。AO染色时细胞中出现红色英光，MDC染色时细胞中出现绿色荧光，说明细胞中出现了自噬溶酶体。Western blot检测时发现异荭草素作用是细胞中自噬特异性的蛋白LC-3II、Beclin-1表达增高，3-MA抑制上述两种蛋白的表达，而RAP作用相反。结论 异荭草素能诱导胃癌SGC-7901细胞死亡，自噬参与了其死亡过程。

异荭草素；自噬；胃癌SGC-7901细胞；3-MA；RAP

异荭草素为一种植物提取物，广泛存在于山楂、鸢尾花等植物，其中西番莲、竹叶、荭草中的含量最为丰富[1-2]。以往的研究发现异荭草素能够通过清除DPPH自由基达到抗氧化的目的[3]。同时抑制小鼠单核细胞中NO的释放进而起到抗炎的作用[2]。随着科学家对异荭草素的深入研究，其保护脏器[4]、治疗糖尿病[5]的功能也逐渐被世人了解。近年来人们逐渐将目光转移到异荭草素的抗肿瘤作用上来，发现其确实能够使肿瘤细胞活性下降[6]，但是抗肿瘤的原因尚不明确，本实验主要探讨自噬对异荭草素与抗肿瘤的关系进而为其抗肿瘤的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞：胃癌SGC-7901细胞(吉林大学转化医学院惠赠)。

1.1.2 药品与试剂：异荭草素(上海永恒生物科技有限公司)；MTT(美国Sigma公司)；DMSO(美国MP Biomedicals公司)；RPML-1640培养基(吉诺生物医药技术有限公司)；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(BIOBOX)(南京碧波生物科技有限公司)；胎牛血清、BCA蛋白定量(美国Thermo Scientific公司)；脱脂奶粉的TBST、TEMED、琼脂糖(国药集团化学试剂有限公司)；吖啶橙(acridine orange，AO)、单丹磺酰戊二胺(monodansylcadaverin，MDC)、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)、雷帕霉素(rapamycin，RAP)(美国Sigma公司)；Beclin-1抗体(英国Abcam公司)；LC3抗体(美国Cell Signaling Technology公司)；二抗(上海生工生物工程有限公司)；PVDF膜(美国Millipore公司)。

1.1.3 实验仪器：超净工作台(德国Heraeus公司)；离心机(美国Sigma公司)；酶标仪Gen5 1.10(美国BioTek公司)；流式细胞仪(美国BD FACS Calibur公司)；LX71倒置荧光显微镜(日本Olympus公司)；220V电泳供电装置PowerPac、165-8001型伯乐小型垂直电泳、221BR Trans-Bolt SD半干转印槽、ChemiDox XRS 凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 MTT检测细胞活性：取消化处于对数生长期的SGC-7901胃癌细胞并将其接种于96孔板上，每孔细胞数为4×105个。之后将其分为4组，对照组加200 μL 0.1%DMSO；异荭草素组加入40 μM的异荭草素200 μL；3-MA组先加1 mM的3-MA反应30 min后加入等量异荭草素；RAP组先加1 μM RAP作用30 min后加入等量异荭草素。处理24、48、72 h后再加入100 μL终浓度为0.5 mg/mL的MTT，37 ℃孵育4h后弃去上层培养液，加入100 μL DMSO溶解蓝紫色结晶，使用酶标仪在490 nm处测定光密度(OD)，并计算抑制率。实验重复5次。

1.2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡：将SGC-7901胃癌细胞接种于培养瓶中隔夜后细胞呈对数生长，之后按1.2.1中分组加入药物，作用48 h后收集细胞，常温1000 r/min离心5 min，弃去培养液，使用预冷PBS重悬细胞后再次按上述条件离心，重复2次。将收集细胞用预冷的75%乙醇固定。再次离心后弃去固定液，用PBS洗涤2次。加入200 μL PI，置于4 ℃环境25 min。使用400目筛网过滤1次后使用流式细胞仪检测细胞凋亡。实验重复3次。

1.2.3 AO和MDC染色：将细胞接种于96孔板中培养过夜后按上述分组加入药物后处理24 h，用PBS洗涤细胞:2次，分别加入100 μL 的1 μg/mL AO，室温孵育15 min后PBS洗涤。荧光显微镜下观察并拍照。

MDC染色时加入100 μL的50 μM MDC ，于37 ℃孵育1 h后用PBS洗涤，荧光显微镜下观察并拍照。

1.2.4 Western blot：按上述分组处理细胞，之后提取蛋白质，并配置相同浓度的蛋白质溶液。配制15%分离胶，4%浓缩胶，30 g蛋白样品上样，调整电压100 V电泳2 h，之后90 V电压PVDF膜转膜90 min，室温下牛奶封闭1 h，1︰1000的LC-3II和Beclin-1，并置于4 ℃过夜，TBST洗涤3次，每次5 min。加入二抗(1:5000)室温下反应1 h，再次使用TBST洗涤。最后化学法发光反应、曝光、拍照并进行灰度值分析。

2 结果

2.1 MTT检测细胞活性 异荭草素作用于SGC-7901胃癌细胞后对细胞活性的抑制存在浓度及时间依赖性，与对照组相比具有统计学意义(P<0.05)，同时自噬抑制剂3-MA作用细胞后细胞的活性抑制率较单用异荭草素时有所下降，而自噬激活剂RAP却相反。见表1。

表1 MTT检测细胞活性Detection of cell activity by ±s，n=5)

*P<0.05，与对照组相比，compared with control group

2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡 流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况，见图1。异荭草素组凋亡率为49.78%，当自噬抑制剂作用是凋亡作用下降为17.38%，而自噬激活剂则促进细胞凋亡为65.04%。

图1 流式细胞仪检测细胞凋亡(n=3)Fig. 1 Detection of cell apoptosis by flow cytometry (n=3)

2.3 AO和MDC染色 AO染色时AO能够进入细胞核中与DNA结合表现出绿色，而当与自噬溶酶体结合后则会出现红色荧光。对照组及3-MA组中几乎无自噬溶酶体出现，而当异荭草素及RAP作用细胞是可见细胞中出现大量自噬溶酶体。同样MDC染色时MDC可与自噬溶酶体结合表现出绿色荧光。异荭草素和RAP作用于细胞后其中出现大量自噬溶酶体。见图2。

图2 AO染色(×100)和MDC染色(×200)Fig.2 AO staining(×100) and MDC staining(×200)

2.4 Western blot检测自噬特征性蛋白的表达 LC-3II和Beclin-1为自噬特征性蛋白，利用Western blot检测这2种蛋白的表达情况来进一步明确异荭草素在诱导胃癌细胞凋亡过程中自噬的影响，见图3。异荭草素作用于胃癌细胞SGC-7901后LC-3II/LC-3I、Beclin-1的灰度值分别为(5.75±0.729)、(5.35±0.973)。与对照组相比，加入自噬抑制剂3-MA后2种蛋白的表达明显下降，而加入自噬激活剂RAP后2种蛋白的表达明显增加(P<0.05)。

图3 Western blot检测自噬蛋白*P<0.05,与对照组相比Fig.3 Detection of autophagy proteins by Western blot*P<0.05，compared with control group

3 讨论

自噬是细胞通过双层膜结构包裹损伤的细胞器、错误折叠的蛋白、侵入的异物等，并将这些物质进行降解的生物学过程[7]。自噬与凋亡一样也属于细胞的一种程序化死亡，随着细胞种类的变化，导致细胞自噬与凋亡发生关系的不同。凋亡与自噬之间即可独立作用细胞，也可相互影响，进而促进或抑制细胞死亡[8]。异荭草素是一种黄酮类物质，存在于多种植物中，之前的研究发现异荭草素具有抑制HepG2肝癌细胞活性的作用，并且对其凋亡的机制也进行了探讨，一方面能启动死亡受体途径导致细胞凋亡，另一方面抑制PI3K/Akt、p-Erk1/2等信号通路，降低线粒体膜电位导致细胞的凋亡[9]。但是异荭草素对胃癌细胞的抑制及其机制未见相关文献报道。本实验将异荭草素作用于胃癌SGC-7901细胞，通过MTT实验发现其活性受到抑制，并且自噬抑制剂3-MA能够阻碍细胞活性的下降，而自噬激活剂RAP作用相反。流式细胞仪检测细胞凋亡也与MTT相吻合。在胃癌SGC-7901凋亡过程中是否存在自噬的参与，AO、MDC染色均发现自噬溶酶体的产生，Western blot也检测到了自噬特征性蛋白LC-3II和Beclin-1，并且其表达受到自噬抑制剂及激活剂的影响，故异荭草素在诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡的过程但中存在自噬的参与。自噬是生物体的一项基本的生理过程，广泛的参与细胞增殖、死亡等一系列过程。尤其是肿瘤细胞当中肿瘤细胞的形成与恶化均与自噬有着密切的联系[9]，而自噬对细胞死亡的具体过程还有待进一步发现。

[1] Prinz S,Ring A,Huefner A,et al. 4-Acetylvitexin-2-O-rhamnoside,isoorientin,orientin,and 8-Methoxykaempferol-3-O-glucoside as markers for the differentiation of Crataegus monogyna and Crataegus pentagyna from Crataegus laevigata[J].Chem.Biodiversity,2007,4(12): 2920-2931.

[2] Conforti F,Rigano D,Menichini F,et al. Protection against neurodegenerative diseases of Iris pseudopumila extracts and their constituents[J].Fitoterapia,2009,80(1):62-67.

[3] Park HS,Lim JH,Kim HJ,et al. Antioxidant Flavone Glycosides from the Leaves of Sasa borealis[J].Arch Pharm Res,2007,30(2): 161-166.

[4] Lin YP, Chen TY, Tseng HW, et al. Neural cell protective compounds isolated from Phoenix hanceana var. formosana. [J].Phytochemistry,2009, 70(9): 1173-1181.

[5] Alonso-Castro AJ,Zapata-Bustos R,Gómez-Espinoza G,et al. Isoorientin reverts TNF-α-induced insulin resistance in adipocytes activating the insulin signaling pathway[J].Endocrinology,2012,153(11):5222-5230.

[6] Pacifico S,Scognamiglio M,D'Abrosca B,et al. Spectroscopic Characterization and Antiproliferative Activity on HepG2 Human Hepatoblastoma Cells of Flavonoid C-Glycosides from Petrorhagia velutina[J].J Nat Prod,2010,73(12),1973-1978.

[7] Codogno P,Meijer AJ. Autophagy and signaling: their role in cell survival and cell death[J].Cell Death Differ,2005,12(2): 1509-1518.

[8] Maiuri MC,Zalckvar E,Kimchi A,et al. Self-eating and self-killing: crosstalk between autophagy and apoptosis[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2007, 8(9): 741-752.

[9] 袁莉.异荭草素对HepG2人肝癌细胞凋亡和自噬的作用及机制研究[M].西安：西北农林科技大学，2014.

(编校：王冬梅)

Effects of isoorientin on autophagy of gastric cancer cell

YU Hai-yao1, LI Shi-hua1, SUN Li-yan1, ZHANG Si-xi2, WANG He-lei2Δ

(1. Changchun Food and Drug Inspection Center, Changchun 130000,China; 2.Department of Pharmacy, The First Hospital of Jilin University, Changchun 130021, China)

ObjectiveTo explore effect of isoorientin on gastric cancer cell autophagy. MethodsIsoorientin and autophagy activator and effect of inhibitors on proliferation of human gastric cancer cell line SGC-7901 by MTT assay. Cell apoptosis was detected by flow cytometry. Production of autophagy lysosomal in gastric cancer SGC-7901 cells was obseroved by AO and MDC staining. Characteristic expression of autophagy protein was analysed by Western blot. ResultsMTT assay indicated that isoorientin could inhibit gastric cancer cell growth, RAP has the same effects, but 3-MA inhibition of apoptosis. Flow cytometry was used to detect the apoptosis rate of isoorientin and RAP could promote cell apoptosis, while 3-MA had the opposite effect. In AO staining, the red light appeared in the cells, and the green fluorescence appeared in the cells of MDC staining, which showed that there was an autophagy in the cells. Western blot test found the isoorientin was cell autophagy specific protein LC-3II, Beclin-1 expression increased, 3-MA suppressed the expression of the two proteins, and RAP had the opposite effect. ConclusionIsoorientin could induce apoptosis in gastric cancer SGC-7901 cells, autophagy is involved in the process of death.

isoorientin; autophagy; gastric cancer cell SGC-7901; 3-MA; RAP

于海瑶，女，硕士，主管药师，研究方向：食品药品微生物药理学，E-mail：514329822@qq.com；王贺雷，通信作者，男，硕士，主治医师，研究方向：消化道肿瘤的综合治疗，E-mail：wsk01342@163.com。

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1005-1678(2015)12-0036-03