红杜仲的美白活性及其途径研究

林锦彬，任桐，连一江，李伟杰，金鑫，夏智波Δ,李文君Δ

(1.厦门大学 医学院，福建 厦门 361102； 2.厦门市手性药物重点实验室，福建 厦门 361102；3.华侨大学 生物医学学院，福建 泉州 362021)



红杜仲的美白活性及其途径研究

林锦彬1,2，任桐3，连一江1,2，李伟杰1,2，金鑫1,2，夏智波1,2Δ,李文君1,2Δ

(1.厦门大学 医学院，福建 厦门 361102； 2.厦门市手性药物重点实验室，福建 厦门 361102；3.华侨大学 生物医学学院，福建 泉州 362021)

目的 研究红杜仲的不同乙醇浓度醇提物对黑色素瘤B16细胞系酪氨酸酶活性、黑素合成的影响，初步探讨红杜仲作为皮肤美白剂或色素沉积药物的可行性。方法 以不同浓度乙醇进行回流分别获得30%、50%、70%、95%乙醇提取的得到4种红杜仲醇提物(PEE30、PEE50、PEE70、PEE95)，选取对蘑菇酪氨酸酶抑制活性最强的提取物；再以B16造模，采用MTS法、NaOH裂解法、L-DOPA氧化法分别测定其对B16细胞的影响；Western blot检测PEE作用后Tyrosinase、TRP-1蛋白表达水平的变化。结果 各红杜仲醇提物在体外均具有抑制蘑菇酪氨酸酶的作用，效果最强的为PEE70。在不影响B16细胞的浓度内，PEE70明显降低B16细胞酪氨酸酶活性和黑素的合成量(P<0. 001)。Western blot结果表明，PEE70能够显著抑制黑素合成相关蛋白Tyrosinase、TRP-1的表达。结论 PEE能直接抑制B16细胞黑色素的合成，可用于美白产品或者色素沉积药物的开发，且上述变化通过抑制酪氨酸酶活性来完成。

红杜仲；B16细胞；黑素合成；抑制作用

白皙和洁润的肌肤一直为绝大多数的妇女所推崇，而近年来随着生活工作节奏的加快以及环境污染的加剧，由各种原因引起的色斑、色素沉着等已成为普遍问题，因此，美白化妆品已成为护肤类化妆品中的主流品种之一。目前，国际上比较认可的黑素合成途径为：酪氨酸-多巴-多巴醌-多巴色素-二羟基吲哚-酮式吲哚-黑素[1]。酪氨酸酶是黑素合成的关键酶和限速酶，其具有独特的双重催化功能，首先催化L-酪氨酸羟基化形成L-多巴，再氧化L-多巴形成多巴醌，之后多巴醌经一系列的酶促和非酶促反应后形成黑色素[2]。

红杜仲药材为夹竹桃科杜仲藤属植物杜仲藤(Parabariummicranthum(A.DC.)Pierre)、红杜仲藤(P.chunnianumTsiang)及毛杜仲藤(P.huaitingiiChunet Tsiang)的茎皮和根皮，或花皮胶藤属花皮胶藤(EcdysantherautilisHay.et Kaw.)的干燥树皮，主要含有生物碱、酚类、有机酸、黄酮等化学成分，红杜仲药材可以治疗风湿骨痛、外伤出血等[3]。但是，目前尚未见红杜仲提取物在美白化妆品方面的报道。本文主要研究红杜仲醇提物的活性部位对酪氨酸酶活性与黑素合成的抑制，为开发红杜仲作为美白原料应用于化妆品提供了一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药材与试剂：红杜仲(厦门鹭燕医药有限公司)。双抗(青霉素、链霉素)、EDTA、胰蛋白酶、PTU(苯硫脲)(美国Sigma公司)；MTS(Promega公司)，α-MSH(上海淘普生物科技公司)；Tyrosinase、TRP-1单抗(Boster公司)。

1.1.2 实验仪器：公司旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)；Ti-S型倒置荧光显微镜(日本Nicon)；多功能酶标仪 SpectraMax M2(Molecular Devices)；冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 红杜仲醇提物的制备：取红杜仲30 g，加480 mL 30%乙醇浸泡40 min，85 ℃水浴回流提取2 h，过滤，滤液置于旋转蒸发仪中减压回收乙醇后得到粗浸膏，将粗浸膏置于-80 ℃后用冷冻干燥机干燥即为PEE30，备用。同样的方法制备PEE50、 PEE70 、PEE95。

1.2.2 蘑菇酪氨酸酶活性抑制实验： 根据Matsuda H[4]的方法并改良进行蘑菇酪氨酸酶活性抑制试验。以 1.5 g/L的左旋多巴为底物，添加80 μL磷酸缓冲液及 40 μL不同浓度(4、8、16 μg/mL)提取物。然后加入30 μL的100 U/mL酪氨酸酶磷酸缓冲液，充分混匀，30 ℃恒温在475 nm处测定吸光度，每5 s记1次数，连续测定30 s，以反应时间对吸光度作图并进行直线拟合，根据样品孔与阳性对照孔直线斜率的变化计算抑制率。阳性对照为曲酸。每组设3个复孔，计算公式如下(式中kT：样品孔直线斜率；kC：阳性对照孔直线斜率)：

蘑菇酪氨酸酶活性抑制率(%)=[1-kT/kC]×100%

IC50值定义为抑制率为50%时所需酪氨酸酶抑制剂的浓度，以样品的浓度对酪氨酸酶的抑制率作图并进行拟合，读取计算IC50值。

1.2.3 B16细胞的培养及细胞增殖活性测定：实验中选择处于对数生长期的B16细胞，调整细胞浓度为2×104个/mL，每孔100 L，接种于96孔培养板，继续培养观察待细胞贴壁后吸去培养液，分别加入含不同浓度红杜仲醇提物的培养液200 μL，同时设置空白对照孔，培养72 h后，MTS法测定各孔吸光值(A)，并按照如下公式计算细胞的存活率，及细胞存活率≥90%作为标准确定红杜仲对细胞的安全浓度。

细胞存活率(%)=A处理/A对照×100%。

1.2.4 细胞酪氨酸酶活性测定[5]：培养B16至对数期，按密度1×105/孔将B16接种于6孔板，每孔2 mL；于37 ℃，5%CO2培养箱中培养。待细胞贴壁后吸去培养液加入2 mL 100 nM的α-MSH(黑色素刺激剂)，24 h后每孔加入不同浓度的醇提物，每一浓度设立3个复孔取平均值，孵育72 h。收集后的细胞每管加入1% Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)150 μL，4 ℃溶解半小时，13000 r/min，4 ℃离心20 min，收集上清液；在96孔板中每孔加入90 μL细胞裂解液和10 μL 0.25%的L-DOPA溶液，在 37 ℃ 反应60 min。用酶标仪在475 nm处测量各孔的吸光度，BCA法测定各孔蛋白含量并计算细胞酪氨酸酶相对活性。每一处理因素重复测定3次。

酪氨酸酶相对活性(%)= [(给药组吸光度值/给药组蛋白浓度吸光度值)/(对照组吸光度值/对照组蛋白浓度的吸光度值)]*100%

1.2.5 细胞黑色素含量测定：细胞的接种密度、处理、培养条件及收获方法同1.2.3。用1000 μL含10%DMSO(二甲基亚砜)的NaOH溶液(1M)溶解，于90 ℃下加热2 h，细胞裂解液吸取100 μL加入到96孔中，405 nm处测定各孔的吸光值，BCA法测定各孔蛋白含量并计算细胞黑色素相对含量。每一处理因素重复测定3次。

黑素合成相对含量(%)= [(给药组黑素含量的吸光度值/给药组蛋白浓度的吸光度值)/(对照组黑素含量的吸光度值/对照组蛋白浓度的吸光度值)]×100%

1.2.6 Western blot法检测Tyrosinase、TRP-1蛋白表达水平[6]：前处理同1.2.3，PIRA裂解取上清完后，BCA法测定蛋白含量，以30 μg蛋白样品为各组上样量进行SDS-PAGE凝胶电泳。湿转法转膜1 h；5%脱脂奶粉封闭1 h；一抗为Tyrosinase (1:200)或者TRP-1(1:200)，β-actin(1:10000)。4 ℃过夜；PBST洗5遍，每次10 min；二抗兔抗山羊或者兔抗摇床孵育1 h，PBST洗5遍，每次10 min；加入ECL底物显色后普光，用ImageJ软件读取灰度值，取目的蛋白灰度值与内参蛋白灰度值的比值。该实验独立重复测定3次，结果以相对于对照组的百分比表示。

2 结果

2.1 不同乙醇浓度红杜仲提取物对蘑菇酪氨酸酶活性的影响 实验证明，阳性药物曲酸的IC50值为(0.004±0.018)， PEE30、PEE50、PEE70、PEE95都能对蘑菇酪氨酸酶的活性产生抑制作用，其抑制蘑菇酪氨酸酶的IC50值分别为(0.246±0.128)、(0.131±0.067)、(0.057±0.044)、(0.069±0.032) mg/mL，效果最好的是PEE70，选取该部分提取物用于后续的实验。

2.2 不同浓度红杜仲醇提物对B16细胞增殖活性的影响 红杜仲70%醇提物作用于B16细胞72 h后，均会对B16细胞生长活性产生不同程度的影响，见图1。由图1可知，在0～20 mg/L浓度范围内，PEE30、PEE50和PEE70作用于B16细胞72 h后的细胞存活率≥90%，定义在该浓度范围为安全浓度；因此，PEE95的安全浓度范围为0～15 mg/L。分别选取对B16细胞无明显毒性(细胞存活率≥90%)的红杜仲提取物用于后续的实验。

图1 不同浓度红杜仲醇提物对B16细胞增殖活性的影响±s，n=3)Fig.1 Effect of different concentration PEE on B16 cell ±s，n=3)

2.3 不同浓度红杜仲醇提物对B16细胞内酪氨酸酶活性的影响 在5～20 mg/L范围内，PEE30效果最差，对酪氨酸酶活性影响差异均无显著性；PEE95只有>10 mg/L才能对B16细胞内酪氨酸酶活力起到明显的抑制作用(P<0.01)。在安全浓度范围内，PEE50、PEE70对胞内酪氨酸酶活力的抑制效果较好(P<0.05，P<0.01)，随着给药浓度的增加， B16 细胞酪氨酸酶活性逐渐降低，呈现较好的剂量依赖性，效果最好的是PEE70(P<0.001)，其对酪氨酸酶活性最高抑制率达到(38±1.072)%。见图2。

图2 不同浓度红杜仲醇提物对B16细胞内酪氨酸酶活性的影响±s，n=3)*P<0.05, **P<0.01, 和***P<0.001，与对照组比较Fig.2 Effect of different concentration PEE on the Tyrosinase activity in*P<0.05, **P<0.01, and ***P<0.001，compared with control group

2.4 不同浓度乙醇红杜仲提取物对B16细胞内黑素含量的影响 不同浓度乙醇红杜仲提取物均能明显降低B16细胞黑素含量(P<0.05，P<0.01)。与对照组相比，效果最佳的是PEE70，在5、10、20 mg/L时使B16细胞中的黑色素分别降低了(10±0.231)%、(27±0.523)%、(36±0.896)%，随着浓度的增加呈现了较好的剂量依赖性，见图3。由图3可知，4种乙醇浓度提取的红杜仲对黑素的合成具有抑制作用，其中，PEE70有最好的美白效果，而后对其进行进一步的验证。

图3 不同浓度乙醇红杜仲提取物对B16细胞内黑素含量的影响±s，n=3)*P<0.05, **P<0.01, 和***P<0.001，与对照组比较Fig.3 Effect of different concentration PEE on the melanin*P<0.05, **P<0.01, and ***P<0.001，compared with control group

2.5 PEE70对Tyrosinase、TRP-1蛋白表达量的影响 黑色素研究表明[7]，酪氨酸酶是生物体内黑色素合成的关键酶，也是黑色素合成的限速酶，它通过将酪氨酸羟化，产生L-3，4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)，然后再将L-DOPA进一步氧化成多巴醌，从而形成黑色素，它的过量表达是导致色素沉着过度的主要原因。

以PEE70为效应物，研究不同浓度效应物对小鼠B16细胞中与黑色素生成相关蛋白Tyrosinase、TRP-1的蛋白表达量的影响，见图4。由图4可知，与空白组相比，加模型组达到了极显著水平(P<0.001)；与模型组相比，浓度为10、20 mg/L的PEE70可导致小鼠B16细胞中Tyrosinase、TRP-1蛋白表达量显著的降低(P<0. 01)，而内参β-actin蛋白的表达量并没有显著变化。说明PEE70可导致黑素合成关键蛋白Tyrosinase及酪氨酸酶相关蛋白1TRP-1都有一定程度上的降解。

图4 不同浓度的PEE70对Tyrosinase、TRP-1蛋白表达量的影响*P<0.05, **P<0.01, 和***P<0.001，与对照组比较Fig.4 Effect of different concentration of PEE70 on Tyrosinase and*P<0.05, **P<0.01, and ***P<0.001，compared with control group

3 讨论

由于化妆品潜在的突变和对皮肤的刺激作用，寻找天然产物作为美白剂成为化妆品行业的一个发展趋势，天然产物既具有较高的安全性，又有一定的生理活性，满足了消费者的需求。红杜仲是我国名贵滋补药材，各国学者相继开展了大量研究以确定红杜仲的活性物质，不同的化学成分并分别具有不同的化学活性。特别是作为壮瑶医常用的药物之一，红杜仲值得进一步深入研究和开发，目前还未见其在美白方向的报道[3]。

本实验通过多种体外实验研究了不同浓度乙醇回流的红杜仲的美白活性，确定PEE70效果最佳，其对B16细胞内的酪氨酸酶活性和黑素合成量的抑制作用都能达到极其显著的抑制作用(与对照组比，P<0.001)，且呈现出良好的剂量依赖性；进一步研究发现，PEE70能够显著降低B16细胞中Tyrosinase、TRP-1的表达(与对照组比，P<0.01)，结合PEE70能够很好的降低蘑菇酪氨酸酶活力、抑制B16细胞内酪氨酸酶的活性，本研究认为PEE70具有抑制皮肤黑素合成的作用，其作用途径与抑制酪氨酸酶的生成量和激活有关。

综上所述，红杜仲在美白化妆品方向上具有一定的开发前景，值得进一步进行活性成分的研究。本实验为红杜仲的进一步应用提供了理论基础，但是由于生物体内黑色素形成与积累过程比较复杂，其抑制途径也是多方面的，因此对于红杜仲是否还可以通过其他途径阻止黑色素的合成与积累有待进一步的深入研究。

[1] Chao HC, Najjaa H, Villareal MO, et al. Arthrophytum scoparium inhibits melanogenesis through the down‐regulation of tyrosinase and melanogenic gene expressions in B16 melanoma cells[J]. Exp Dermatol, 2013, 22(2): 131-136.

[2] Huang HC,Chang SJ, Wu CY, et al. [6]-Shogaol Inhibits α-MSH-Induced Melanogenesis through the Acceleration of ERK and PI3K/Akt-Mediated MITF Degradation[J]. Biomed Res Int, 2014, 2014: 842569.

[3] Wu FJ,Wei YY,Lu SH, et al. The Research Situation of Red Eucommia Herbs [J]. J Guangxi Acad Sci, 2010 (3): 377-379.

[4] Matsuda H, Nakashima S, Oda Y, et al. Melanogenesis inhibitors from the rhizomes of Alpinia officinarum in B16 melanoma cells[J]. Bioorg Med Chem, 2009, 17(16): 6048-6053.

[5] Komori Y, Imai M, Yamauchi T, et al. Effect of p-aminophenols on tyrosinase activity[J]. Bioorg Med Chem, 2014, 22(15): 3994-4000.

[6] Huang YC, Liu KC, Chiou YL, et al. Fenofibrate suppresses melanogenesis in B16-F10 melanoma cells via activation of the p38 mitogen-activated protein kinase pathway[J]. Chemico Biol Interact, 2013, 205(3): 157-164.

[7] Lin JY, Fisher DE. Melanocyte biology and skin pigmentation[J]. Nature, 2007, 445(7130): 843-850.

(编校：王冬梅)

Study on the Whitening activity and pathway of red eucommia herbs

LIN Jin-bin1,2, REN Tong3, LIAN Yi-jiang1,2, LI Wei-jie1,2, JIN Xin1,2, XIA Zhi-bo1,2Δ, LI Wen-jun1,2Δ

(1.Medical College,Xiamen University,Xiamen 361102,China; 2.Xiamen Key Laboratory of Chiral Drugs, Xiamen 361102,China； 3.School of Biomedical Science, Huaqiao University, Quanzhou 362021, China;)

ObjectiveTo determine the impact of PEE with different ethanol concentration extract on the activity of tyrosinase in B16 melanoma and to explore the feasibility of PEE used as skin whitening agent make use of a model organism.Methods30%, 50%, 70%, 95%,different concentration of ethanol reflux got four kinds of PEE alcohol extract, respectively. And selected the most active inhibition to mushroom tyrosinase(PEE30、PEE50、PEE70、PEE95). The effect of extracts from the selected on B16 cell model was determined by MTS, NaOH splitting decomposition, L-DOPA oxidation progress. The change in protein expression level after ethanol extract of PEE was determined by Western bolt.ResultsThe capacity of inhibition to mushroom tyrosinase in each concentration of PEE extraction, but PEE70 had the most active inhibition. When challenged with B16 cell model, PEE70 showed the capacity of decrease in tyrosinase activities and melanin synthesis (P<0.01) and had a does dependence ; it also decreased Tyrosinase and TRP-1 expression compared with control B16 cells.ConclusionThese data support the idea that PEE can restrain melanogenesis, through its inhibitory effect on the activity of tyrosinase.

red eucommia herbs; B16 cells; melanin synthesis; inhibition effect

林锦彬，男，硕士，实验员，研究方向：中药活性成分研究，E-mail：704959837@qq.com；夏智波，通信作者，男，副教授，研究方向：中医药研究，E-mail:xiazhibo@xmu.cdu.cn;李文君，共同通信作者，女，硕士，高级实验师，研究方向：糖尿病、脑缺血等，E-mail:liwenjun@xmu.edu.cn。

R285

A

1005-1678(2015)12-0021-04