VEGF水平与恶性胸腔积液的相关性研究

刘洪建,王玉波,解桢,张庆广

(滨州医学院附属医院 胸外科，山东 滨州 256600)



VEGF水平与恶性胸腔积液的相关性研究

刘洪建,王玉波,解桢,张庆广

(滨州医学院附属医院 胸外科，山东 滨州 256600)

目的 探讨血清及胸腔积液中VEGF水平在良、恶性肿瘤中的诊断价值，并评价VEGF-A,C,D在诊断恶性胸腔积液中的临床应用。方法 从滨州医学院附属医院住院治疗的患者中，选择肺癌且伴有胸腔积液者，共34例，收集其血清及胸腔积液，采用双抗体夹心ELISA法检测胸腔积液及血清VEGF及VEGF-A，C，D浓度。同时测定34例良性胸腔积液患者的血清及胸腔积液VEGF水平情况，并进一步检测恶性浆膜腔积液患者外周血清，积液上清VEGF-A，C，D的浓度。结果 血清及胸腔积液VEGF水平恶性组均显著高于良性组(P<0.05)。另外，初治前肺癌患者血清及胸腔积液VEGF水平，有远处转移组明显高于尚未有远处转移组(P<0.05)。VEGF水平与恶性胸腔积液存在相关性(r=0.878,P<0.05)。VEGF水平与良性胸腔积液无相关性。血清sVEGF-A含量在恶性组及良性组无统计学差别。积液上清pVEGF-A含量在恶性组高于良性积液组(P<0.05)，在恶性积液中显示pVEGF-A明显高于sVEGF-A水平(P<0.05)。血清sVEGF-C，sVEGF-D含量在恶性组及良性组无统计学差别。积液上清pVEGF-C，pVEGF-D含量在恶性组及良性组无统计学差别。结论 检测血清及胸腔积液中VEGF水平有助于良恶性胸腔积液的诊断和鉴别诊断。积液上清VEGF-A在良恶性积液有差异，提示可能成为良恶性积液的肿瘤标志物。

胸腔积液；血管内皮生长因子；肿瘤；VEGF-A；VEGF-C；VEGF-D

恶性胸腔积液患者中位生存时间为4.7 个月，23%患者为1年，7%患者为2年[1-3]。这些数据提示临床前研究的重要性，以提高恶性积液的诊断及治疗。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在1980年被发现，同时发现其在积液形成中有重要作用[4]。肿瘤浸润或转移至胸腹后VEGF水平的升高、肿瘤新生血管的生成以及血管通透性增加等是浆膜腔内积液形成的重要机制，VEGF是组胺血管渗透能力的50000倍。VEGF被认为是有前景的标志物[5]。VEGF家族包括6种类型：VEGF-A、B、C、D、E和胎盘生长因子(placental growth factor，PIGF)，主要由肿瘤细胞和巨噬细胞分泌，VEGF-A 是肿瘤血管生成中最重要的调控因子，VEGF-C 和 VEGF-D 是肿瘤淋巴管生成中最重要的调控因子[6]既往研究多集中于血管。即VEGF-A 的研究，而很少关注淋巴因子的作用。Ishii[7]等建立稳定的肺癌细胞克隆(TKB5/VEGF-A, TKB5/VEGF-C, TKB5/VEGF-D，TKB5/VEGF-A/C，TKB5/VEGF-A/D)，接种于裸鼠胸腔，结果证明 VEGF-A 在产生积液方面及血管新生方面发挥了重要作用， VEGF-D在胸膜播散及淋巴结转移方面有作用。Ma[8]等建立小鼠的恶性胸膜腔积液模型，在重组人血管内皮抑制素注射液的高剂量组(30 mg/kg)，胸腔积液量及VEGF-A，VEGF-C 明显低于低剂量组(8 mg/kg)、贝伐单抗(5 mg/kg)和生理盐水组。以上基础实验为VEGF-C及VEGF-D在浆膜腔积液的发生机制中的作用，提供了一定的理论基础。

本研究将VEGF作为研究指标，分别检测了良、恶性胸腔积液VEGF水平和血清中的VEGF水平，探讨VEGF水平与恶性胸腔积液形成之间的关系，并进一步通过检测恶性浆膜腔积液患者外周血清，积液上清及细胞水平VEGF-A,C,D的蛋白含量及表达，探讨三因子在积液诊断方面的临床意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象 随机选择2012年7月1日～2013年1月30日，滨州医学院附属医院浆膜腔积液初诊的患者为研究对象，根据患者积液的苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)及免疫组化结果确诊为癌症及未见癌患者，收集其血清，积液上清及细胞涂片，并随访至 2014年1月25日。最终选取积液上清共68例(原发肺癌所致恶性积液34例，良性积液34例)。68例外周血清(原发肺癌所致恶性积液34例，良性积液34例)。

1.2 试剂与仪器 TGL-16B台式离心机(上海)，微孔板振荡器(日本)，Ependorf管(苏州)， BIO-TEK ELX800 全自动酶标仪(美国)，VEGF-A ELISA 试剂盒(NeoBioscience 公司) ，VEGF-C ELISA 试剂盒(美国RayBiotec 公司)，VEGF-D ELISA 试剂盒(美国 ImmunoWay 公司)，兔抗人 VEGF-C 抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)， 兔抗人VEGF-A抗体(美国Bioworld Technology公司)，浓缩 DAB 试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，兔VEGF-D抗体(美国Bioworld Technology公司)，免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)：试剂 A(蓝色液体)为封闭用正常山羊血清工作液；试剂B(黄色液体)为生物素化二抗工作液、SP-9001：羊抗兔 IgG；试剂 C(橙色液体)为辣根酶标记链霉素卵白素工作液(S-A/HRP)。

1.3 方法

1.3.1 标本的采集：外周血的采集，自患者肘静脉处抽取晨起空腹外周血2 mL；胸腔积液的采集，通过胸腔穿刺收集胸腔积液 5 mL；采用台式离心机，于4 ℃3000 r/min条件下离心 10 min，提取上清液，分别置于冰箱中，-20 ℃保存。

1.3.2 VEGF水平检测：采用双抗体夹心 ELISA法检测胸腔积液及血清VEGF及VEGF-A，VEGF-C，VEGF-D 浓度，采用同一批试剂，实验步骤按照说明书进行。

2 结果

2.1 各组中血清、胸腔积液VEGF水平 结果显示恶性组血清和胸腔积液中VEGF水平均高于良性对照组(P<0.05)，见表1。

表1 血清与胸腔积液中VEGF水平比较Tab.1 Comparison of VEGF levels in serum and pleural ±s,pg/mL)

2.2 VEGF浓度水平在初治前恶性组(M1)与未转移组(M0)的表达 将初治前恶性组患者，以有、无远处转移分为转移组(M1)和未转移组(M0)，2组患者血清浓度、胸腔积液浓度进行比较，结果显示转移组VEGF水平高于未转移组(P<0.05)，见表2。

表2 未转移组与转移组VEGF水平比较Tab.2 Comparison of VEGF levels in without metastasis and metastasis ±s,pg/mL)

2.3 VEGF水平与良，恶性胸腔积液的相关性 经Spearman相关性研究分析，VEGF水平与恶性胸腔积液存在相关性(r=0.878,P<0.05)。VEGF水平与良性胸腔积液无相关性。

2.4 恶性和良性组胸腔积液中VEGF-A，VEGF-C，VEGF-D水平比较 积液上清pVEGF-A含量在恶性组高于良性积液组(P<0.05)。血清sVEGF-A含量在恶性组及良性组差异无统计学意义。在恶性积液中显示pVEGF-A 明显高于sVEGF-A水平(P<0.05)。积液上清pVEGF-C，pVEGF-D及血清sVEGF-C，sVEGF-D含量在恶性组及良性组差异无统计学意义，见表3。

表3 恶性组和良性组胸腔积液中VEGF-A，VEGF-C，VEGF-D水平比较Tab.3 Levels of VEGF-A, -C and -D proteins in benign and malignant pleural ±s，pg/mL)

#P<0.05，与良性组相比，compared with benign group；ΔP<0.05，与血清水平比较，compared with serum level

3 讨论

血管内皮生长因子(VEGF)是一种特异性作用于血管内皮细胞的一类生长因子。Mohammed KA[9]指出，血管内皮生长因子(VEGF)结合微血管内皮细胞基底膜和小泡囊状细胞器，使小泡囊状细胞器的活性增加，导致血管内大分子物质的渗出，是目前已知的最强的血管渗透剂，对血管通透性比组胺大5万倍左右。Yano S[10]指出，VEGF与其受体结合后，增加了血管通透性，使血浆蛋白外渗，进而为胸腔积液的形成提供了理想的微环境。因此VEGF可能是诱发恶性胸腔积液的重要原因。

本研究结果显示：在肺癌患者胸腔积液中，VEGF水平恶性患者明显高于良性患者(P<0.01)。可以认为 VEGF水平在良、恶性胸腔积液中具有鉴别诊断意义和诊断价值。同时相关性分析显示，VEGF水平与恶性胸腔积液存在相关性(r=0.878,P<0.05)。

本研究数据显示， VEGF水平在胸腔积液和血清水平中，前者含量明显高于后者，所以认为在胸腔渗出液积聚过程中VEGF起到了重要作用，通过测定胸腔积液中 VEGF水平来鉴别良、恶性胸腔积液是有意义的。有研究指出[11]，在中国和美国，胸腔积液中恶性胸腔积液占渗出性胸腔积液的第2位，故通过胸腔积液中 VEGF水平进行早期诊断具有重要意义。

本研究显示积液上清VEGF-A 水平高于其血清值，分析原因在于浆膜腔中标志物不易进入血循环被肝脏灭活，而血清学指标易受全身代谢等多种因素影响，故浓度不及浆膜腔因子浓度高。VEGF-A积液上清水平在诊断方面，本研究显示上清VEGF-A良恶性有差异，与既往文献[12-14]一致。临床病理因素方面，本研究显示，VEGF-A含量在恶性积液高于良性，与之前研究一致。本研究显示，VEGF-C,VEGF-D的血清及上清水平在良恶性积液均未见统计学差异。很多研究都在开展以VEGF为靶点进行抑制肿瘤生长的研究[10，15-16]。

结合既往文献分析，VEGF尽管是分泌型蛋白，可以在外周血及积液测出蛋白水平，但一些因子，如VEGF-C，VEGF-D释放的生物活性形式不同，所以，识别重要的生物活性形式及何种形式对临床实践很重要。VEGF同样参与了病理性炎症的发生，尤其在脓性积液的发生及结核病变的渗出期尤为明显，需联合炎性或结核的分子标志物加以比较，方可提高其诊断良恶性的敏感性。未来需进一步扩大样本量及良性积液的病种。

[1] Heffner JE,Nietert PJ,Barbieri C.Pleural fluid pH as a predictor of survival for patients with malignant pleural effusions[J].Chest,2000,117(1):79-86.

[2] Creaney J,Robinson BWS.Serum and pleural fluid biomarkers for mesothelioma[J].Curr Opin Pulm Med,2009,15(4):366-370.

[3] Aziz T,Jilaihawi A,Prakash D.The management of malignant pleural mesothelioma; single centre experience in 10 years[J].Eur J Cardiothorac Surg,2002,22(2):298-305.

[4] SengerDR,Galli SJ,Dvorak AM,et al.Tumour cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of a scities fluid[J].Science,1983,219(4587):983-985.

[5] Grove CS,Lee YC.Vascular endothelial growth factor:the key mediator in pleural effusionformation[J].Curr Opin Pulm Med,2002,8(4):294-301.

[6] 于浩，盛修贵，张师前.肿瘤淋巴管生成研究进展[J].中华肿瘤防治杂志，2013，20(8)：637-640.

[7] Ishii H,Yazawa T,Sato H,et al.Enhancement of pleural dissemination and lymph node metastasis of intrathoracic lung cancer cells by vascular endothelial growth factors(VEGFs) [J].Lung Cancer,2004,45(3):325-337.

[8] Ma X, Yao Y, Yuan D, et al. Recombinant human endostatin endostar suppresses angiogenesis and lymphangiogenesis of malignant pleural effusion in mice[J].PLoS One,2012,7(12):e53449.

[9] Mohammed KA,Nasreen N,Hardwick J,et al .Bacterial induction of pleural mesothelial monolayer barrier dysfunction[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2001,281(1): 119-125.

[10] Yano S,Herbst RS, Shinohara H,et al.Treatment for malignant pleural effusion of human lung adenocarcinoma by inhibition of vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinase phos-phorylation[J].Clin Cancer Res,2000,6(3):957-965.

[11] 谢灿茂.胸膜疾病的流行情况[J].中华结核和呼吸杂志，2001，24(1)：12-13.

[12] Karatolios K, Pankuweit S, Moosdorf RG,et al.Vascular endothelial growth factor in malignant and benign pericardial effusion[J].Clin Cardiol,2012,35(6):377-381.

[13] Shen YC,Liu MQ,Wan C,et al.Diagnostic accuracy of vascular endothelial growth factor for malignant pleuraleffusion: A meta-analysis[J].Exp Ther Med,2012,3(6):1072-1076.

[14] Jankowska R, Porebska I,Dyla T.Evaluation of vascular endothelial growth factor(VEGF) in neoplastic and tuberculosis effusions--preliminary results[J].Pneumonol Alergol Pol,2002,70(5-6):258-264.

[15] Verheul HM,Hoekman K,Jorna AS,et al.Targeting vascular en- dothelial growth factor blockade: ascites and pleural effusion formation[J].Oncologist,2000,5(suppl 1):45-50.

[16] Wood JM. Inhibition of vascular endothelial growth factor(VEGF) as a novel approach for cancer therapy[J].Medicina(B Aires),2000,60(suppl 2):41-47.

(编校：谭玲)

Study on correlation between VEGF level and malignant pleural effusion

LIU Hong-jian,WANG Yu-bo, XIE Zhen, ZHANG Qing-guang

(Department of Thoracic Surgery, The Affiliated Hospital of Binzhou Medical College, Binzhou 256600, China)

ObjectiveMethods To explore the value of VEGF levels in serum and pleural effusion for diagnosis of benign and malignant tumors, and evaluate clinical value of VEGF-A, C, D in malignant pleural effusion.MethodsSerum and pleural effusion of 34 cases patients with lung cancer were collected in our hospital, the application of ELISA method for the detection of VEGF level in serum and pleural effusion in patients with lung cancer and with benign pleural effusion. VEGF-A, C, D levels were detected.ResultsVEGF levels in serum and pleural effusion in malignant group were significantly higher than those in benign group(P<0.05). In addition, patients with lung cancer before initial treatment, the VEGF levels in serum and pleural effusion of distant metastasis group were significantly higher than those of without distant metastasis group(P<0.05). There was a correlation between the level of VEGF and the malignant pleural effusion(r=0.878,P<0.05). No correlation existed between VEGF level and benign pleural effusion. The content of sVEGF-A in serum had no statistical difference in cancer group and benign group. Effusion supernatants of pVEGF-A content in lung cancer group were higher than those in benign effusion group(P<0.05). pVEGF-A and sVEGF-A levels were similar in benign effusion group. Effusion supernatants pVEGF-A in malignant group was higher than that in benign effusion group(P<0.05). pVEGF-A was significantly higher than that of sVEGF-A in malignant effusion(P<0.05). Serum VEGF-C, VEGF-D content had no significant difference between cancer group and benign group. pVEGF-C, pVEGF-D content had no significant difference between cancer group and benign group.ConclusionLevel of VEGF in serum and pleural effusion detection would help to diagnose and differentially diagnose benign and malignant pleural effusion. Effusion VEGF-A is different in benign and malignant effusion, which may become benign and malignant effusion tumor markers.

pleural effusion; vascular endothelial growth factor; tumor; VEGF-A; VEGF-C; VEGF-D

刘洪建，男，硕士，主治医师，研究方向：胸部肿瘤的基础与临床研究，E-mail：yixvebianjis@163.com。

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1005-1678(2015)03-0141-03