复方鹿角胶囊对小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO和淋巴细胞增殖的影响

陈东亚,李舸远,俞萍,吕中明,杨明晶,梁婕Δ

(1.江苏省疾病预防控制中心 毒理与功能评价所，江苏 南京 210009；2.江苏省食品药品监督检验研究院化学室，江苏 南京 210008)



复方鹿角胶囊对小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO和淋巴细胞增殖的影响

陈东亚1,李舸远2,俞萍1,吕中明1,杨明晶1,梁婕1Δ

(1.江苏省疾病预防控制中心 毒理与功能评价所，江苏 南京 210009；2.江苏省食品药品监督检验研究院化学室，江苏 南京 210008)

目的 研究复方鹿角胶囊对小鼠腹腔巨噬细胞NO分泌、淋巴细胞增殖的影响。方法 ICR小鼠随机分为4组，实验组小鼠分别灌胃给予233、467、1400 mg/kg的复方鹿角胶囊，对照组以等容积纯净水灌胃，1次/天，连续30 d。处死动物，Griess法测定腹腔巨噬细胞NO含量；流式细胞术测定由刀豆蛋白 (concanavalin A，Con A)活化的淋巴细胞增殖周期；荧光染色法测定经ConA和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)活化的淋巴细胞内Ca2+浓度。结果 与溶剂对照组相比，233、467、1400 mg/kg剂量组均促进经LPS活化的腹腔巨噬细胞分泌NO(P<0.01)；467、1400 mg/kg剂量组比溶剂对照组有更多的淋巴细胞进入S期和G2/M期(P<0.05)；经ConA刺激8 min，各剂量组Ca2+浓度均高于对照组，其中233、1400 mg/kg剂量组小鼠淋巴细胞内Ca2+浓度与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)；经LPS刺激1、4、8 min，各剂量组Ca2+浓度均高于对照组，其中233 mg/kg剂量组淋巴细胞内Ca2+浓度与对照组相比差异有统计学意义，尤其以1 min时效果最为明显(P<0.01)。结论 复方鹿角胶囊能促进小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO，促进活化的淋巴细胞进入S期和G2/M期及淋巴细胞内Ca2+浓度升高，促进淋巴细胞增殖，提高机体免疫调节力。

复方鹿角胶囊；巨噬细胞；NO；淋巴细胞；Ca2+

传统中药材丹参、赤芍、白芷能提高机体免疫调节活性的研究常见报道[1-3]，鹿角含有丰富的活性物质并具有广泛的药理活性，目前可见报道其可以预防骨质疏松、抗衰老和疏通乳腺[4-6]，本实验使用的复方鹿角胶囊的主要成分为鹿角粉，配以丹参提取物、赤芍提取物和白芷提取物，其是否具有调节机体免疫能力目前未见报道。机体淋巴细胞和巨噬细胞作为免疫系统中重要的参与细胞，在免疫应答中起关键作用。本实验从复方鹿角胶囊对巨噬细胞分泌NO、对淋巴细胞增殖周期和Ca2+的影响这个角度出发，探讨其是否具有提高机体免疫调节活性并为保健食品增强免疫力功能检测新方法的探索提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物清洁级ICR小鼠(雌性，5～6周龄，18～22 g)购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[动物生产许可证号：SCXK(沪)2012-0002号]；全部动物均给予灭菌鼠饲料和灭菌水，灭菌鼠饲料来源及合格证号：苏州双狮实验动物饲料科技服务有限公司，苏E饲生字(2009)05032号。

1.1.2 主要试剂和仪器复方鹿角胶囊由某保健品企业提供；刀豆蛋白A(concanavalinA，ConA)、碘化丙碇(propidium iodide，PI)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)购自美国Sigma公司；Fluo-4/AM购自日本DoJinDo公司；Griess试剂盒购自美国Promega公司；RPMI1640完全培养基，Hank’s液购自美国GIBCO公司；无支原体新生小牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司；多功能酶标仪SpectraMax购自美国Molecular Devices公司；流式细胞仪为BD Accuri®C6购自美国Becton Dickinson公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及处理：雌性小鼠随机分为4组，每组10只。实验设为溶剂对照组，低剂量组(233 mg/kg)，中剂量组(467 mg/kg)，高剂量组(1400 mg/kg)，经口灌胃给予小鼠，灌胃容积为20 mL/kg，溶剂对照组以等容积纯净水灌胃，连续灌胃30 d后测定各项指标。

1.2.2 小鼠腹腔巨噬细胞在LPS刺激后NO的分泌情况的检测：颈髓脱臼处死小鼠，腹腔注射5 mL RPMI1640完全培养基，轻揉腹部2 min，吸取腹腔内含有巨噬细胞的完全培养基，计数后，调整细胞密度为2×105/mL，每孔1 mL细胞悬液接种于24孔板，37 ℃、5%CO2培养箱过夜，此时巨噬细胞贴于孔底，轻轻吸除培养液后，再用RPMI1640完全培养液洗去未贴壁细胞，加入终浓度为10 μg/mL的LPS刺激24 h，按照Griess试剂盒说明书操作绘制标准曲线并检测试验孔的OD值。

1.2.3 脾淋巴细胞的制备：颈髓脱臼处死小鼠，无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hank’s液洗2次，每次离心10 min(1500 r/min)。然后将细胞悬浮于1 mL的完全培养液中，用台酚蓝染色计数活细胞数(应在95%以上)。

1.2.4 复方鹿角胶囊对小鼠脾淋巴细胞周期分布的影响：取1.2.3中获取的脾淋巴细胞，调整细胞浓度为1×106/mL，每孔1 mL加入24孔培养板，每孔加75 μLConA(相当于7.5 μg/mL)，于72 h收集细胞，1500 r/min离心15 min，细胞沉淀用70%冰乙醇固定，4 ℃冰箱放置12 h以上。固定后的细胞用Hank’s液洗2遍，加入500 μL PI染液(50 μg/mL)，混匀后于4 ℃避光放置1 h，经200目尼龙网过滤，在流式细胞仪上检测细胞周期分布情况，计数8000个淋巴细胞，重复4次。

1.2.5 复方鹿角胶囊对小鼠脾淋巴细胞内Ca2+浓度的影响：取1.2.3中获取的脾淋巴细胞，调整细胞浓度为1×107/mL，同一细胞悬液分别加入24孔板的2个孔，每孔1 mL，每孔加入5 μL Fluo 4-AM染液(相当于5 μmol/L)，37 ℃避光孵育30 min，用Hank’s液洗涤细胞(2500r/min，10 min)3遍，1 mLHank’s液重悬细胞，分别加入终质量浓度4.5 μg/mLConA，20 μg/mL LPS，在加入有丝分裂原前4 min，用多功能酶标仪测定细胞内荧光强度F值，激发波长494 nm，发射波长516 nm，加入有丝分裂原后在1、4、8 min分别测定F值，然后加10%Tritonx-100，剂量为10 μL/孔，以破坏细胞膜测定最大荧光值(Fmax)，再加300mmol/LEGTA，每孔200 μL，络合全部的Ca2+以测定最小荧光值(Fmin)；另外用1640培养液作为空白对照测定自身荧光值。Ca2+浓度的计算公式为：[Ca2+]i=Kd(F-Fmin/Fmax-F),Kd为染料与Ca2+的解离常数，Kd=360 nmol/L。

1.3 统计学方法 获取的流式细胞数据用FlowJo7.6.1软件分析，所有数据统计均用SPSS17.0软件进行方差分析。

2 结果

2.1 复方鹿角胶囊对LPS刺激后小鼠腹腔巨噬细胞NO分泌的影响 根据实验得出的标准曲线方程y=144.28x-8.3219，R2=0.9992，其中x为吸光值，y为NO含量( μmol/L),将实验组测得的吸光值代入该方程，得到相应的NO量。可见剂量组的NO浓度高于溶剂对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

表1 复方鹿角胶囊对LPS刺激后腹腔巨噬细胞NO分泌的影响±s，n=6)Tab.1 Effects of Compound Antler capsule on NO secretion of mice macrophages stimulated by LPS for ±s，n=6)

*P<0.01，与对照组相比，compared with control group

2.2 复方鹿角胶囊对小鼠脾淋巴细胞周期分布的影响 淋巴细胞经流式细胞仪测定，得图1结果，图形结果经FlowJo软件分析表明，ConA刺激72h后，剂量组与溶剂对照组相比，更多的淋巴细胞进入S、G2/M期，其中467 mg/kg剂量组有(22.07±1.89)%的细胞进入G2/M期(P<0.05)，1400 mg/kg剂量组有(22.78±3.36)%的细胞进入S期(P<0.05)，见表2。

组别细胞周期百分比(%)G0/G1SG2/M对照组+ConA63.86±1.30 16.51±2.11 17.97±1.93 233mg/kg剂量组+ConA61.95±1.5717.59±0.6218.48±0.82467mg/kg剂量组+ConA59.45±4.2116.62±1.9822.07±1.89*1400mg/kg剂量组+ConA57.67±3.93*22.78±3.36*18.53±1.38

*P<0.05，与对照组相比，compared with control group

2.3 复方鹿角胶囊对小鼠脾淋巴细胞内[Ca2+]i的影响 经Fluo 4-AM染色，结果显示各剂量组在加有丝分裂原刺激前4 min，剂量组淋巴细胞内Ca2+浓度高于溶剂对照组，但无统计学差异，加ConA8 min后，233、1400 mg/kg剂量组胞内Ca2+浓度高于溶剂对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3，加LPS后1 min起，233 mg/kg剂量组的Ca2+浓度高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表3 复方鹿角胶囊对ConA激活的小鼠脾淋巴细胞内[Ca2+]i的影响±s，n=6)Tab.3 Effects of Compound Antler capsule on[Ca2+]i of activated mice spleen lymphocytes by ±s，n=6)

*P<0.05，与对照组相比，compared with control group

表4 复方鹿角胶囊对LPS激活的小鼠脾淋巴细胞内[Ca2+]i的影响Tab.4 Effects of Compound Antler capsule on[Ca2+]i of activated mice spleen lymphocytes by ±s，n=6)

*P<0.05，**P<0.01，与对照组相比，compared with control group

3 讨论

增强免疫力功能近年来一直是保健食品研究的热点，每年都有大量的保健食品提出申报具有该功能。本实验室每年承担着大量保健食品的安全性及功能评价工作，本研究在常规检测项目以外，以小鼠腹腔巨噬细胞和淋巴细胞作为研究对象，探讨了该保健食品增强免疫力的功能的可能机制，也为增强免疫力功能检测新方法的探索提供参考。

巨噬细胞作为机体免疫系统的重要成员之一，在机体免疫调节过程中起着吞噬、抗原提呈和分泌多种活性介质的作用。巨噬细胞通过反应性氮中间物作用系统产生NO，从而发挥杀灭微生物及癌细胞的作用，随着NO的增加，巨噬细胞具有更强的吞噬功能[7-9]。本实验结果显示，复方鹿角胶囊使活化的巨噬细胞产生的NO浓度高于溶剂对照组，且有统计学意义。这说明该胶囊能提高巨噬细胞产生NO的能力，增强巨噬细胞免疫调节活性。

脾脏是机体最大的免疫器官，储存着大量的T淋巴细胞和B淋巴细胞。淋巴细胞的增殖能力直接反映了机体免疫力水平。在《保健食品评价技术规范》中，增强免疫力功能检测项目中有一项就是检测淋巴细胞转化增殖实验。细胞的增殖需要经过一系列的环节，如DNA复制、有丝分裂等细胞周期才能增殖，因此细胞是否增殖与细胞周期分布密切相关[10]。T淋巴细胞在相关淋巴因子和周期相关蛋白的作用下从G0/G1静息期过渡到S期，最后进入G2/M分裂期，增殖周期的变化，能直接反映机体免疫功能[11]。本实验采用PI染色，流式细胞术观察复方鹿角胶囊对淋巴周期的影响，发现该胶囊能促进淋巴细胞进入S期和G2/M期，起到促淋巴细胞增殖的作用。

Ca2+是细胞增殖活化过程中必不可少的离子，淋巴细胞内Ca2+作为淋巴细胞激活、增殖过程中的信使分子，在传递抗原等外界分子的刺激、启动相关基因的转录及其后续过程中起着重要作用[12]。ConA和LPS能分别激活T、B淋巴细胞，增加细胞内Ca2+浓度[13-15]。本实验结果表明复方鹿角胶囊能增加静息淋巴细胞内Ca2+浓度，并能进一步增加经ConA和LPS活化的淋巴细胞内Ca2+浓度。这表明复方鹿角胶囊对活化淋巴细胞有促进作用。但实验结果中LPS刺激的低剂量组Ca2+浓度在1 min左右即有明显升高，ConA刺激组低剂量和高剂量组在1 min左右Ca2+浓度却有所下降，4 min开始升高，这可能与激活不同的钙离子通道有关，具体机制有待进一步探索。

以上实验表明，复方鹿角胶囊能促进淋巴细胞增殖，机制为通过升高淋巴细胞内Ca2+，诱导淋巴细胞进入S期，G2/M期，从而促进淋巴细胞增殖，该胶囊还能提高巨噬细胞产生NO能力，从而提高机体巨噬细胞吞噬能力。笔者认为本实验研究结果结合《保健食品评价技术规范》中的检测项目，能更全面的反映保健食品是否具有增强免疫力功能。

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(编校：谭玲)

Effects of Compound Antler capsule on NO secretion of macrophages and proliferation of T lymphocytes in mouse

CHEN Dong-ya1,LI Ge-yuan2,YU Ping1,LV Zhong-ming1,YANG Ming-jing1,LIANG Jie1

(1.Institute of Toxicology and Functional Assessment, Jiangsu Provincial Center for Disease Control and Prevention, Nanjing 210009, China; 2.Chemical Formula, Jiangsu Institute for Food and Drug Control, Nanjing 210008, China)

ObjectiveTo explore the effects of Compound Antler capsule on the NO secretion of macrophages, cell cycle and[Ca2+]iof mouse T lymphocytes.MethodsICR mice were randomly divided into 4 groups: experimental groups were respectively given Compound Antler capsule 233, 467, 1400 mg/kg via intragastric administration once a day and the control group were given the same volume of water for 30 days.NO concentration of mouse peritoneal macrophages was measured by Griess assay.The cell cycle distribution of activated mouse spleen lymphocytes was measured by flow cytometry.Fluorescent probe Fluo 4-AM was used to mark Ca2+in lymphocytes, and the changes of its fluorescence intensity were observed with the multiscan spectrum.ResultsThe result showed that NO concentration in experimental groups was higher than that in control group (P<0.01).More activated spleen lymphocytes of 467, 1400 mg/kg dose groups were entried into S and G2/M phase than control group (P<0.05).After activated by ConA for 8 min, the intracellular[Ca2+]iin mouse spleen lymphocytes of 233, 1400 mg/kg dose group was higher than that of control group, respectively (P<0.05).After activated by LPS for 1, 4, 8 min, the[Ca2+]iin mouse spleen lymphocytes of 233 mg/kg dose group was higher than that of control group, especially at 1 min(P<0.01).ConclusionCompound Antler capsule can improve NO secretion of macrophages and facilitate the entry of mouse spleen lymphocytes from the G0/G1 into the S phase.It also can increase the[Ca2+]iof activated lymphocytes to promote their proliferation.Thus Compound Antler capsule can improve the immune regulating ability.

Compound Antler capsule; macrophages; NO; lymphocytes; Ca2+

陈东亚，女，硕士，主管技师，研究方向：保健食品安全性及功能评价，E-mail：yadd522@163.com；梁婕，通讯作者，女，硕士，主管医师，研究方向：保健食品安全性及功能评价，E-mail：70641911@qq.com。

R285.5

A

1005-1678(2015)03-0018-03