石榴汁对慢性脑低灌注大鼠认知行为的影响及其作用机制研究

张建斌,李小慧

(1.长治医学院附属和济医院 神经内科，山西 长治 046011；2.长治医学院附属和济医院 神经康复科，山西 长治 046000)



石榴汁对慢性脑低灌注大鼠认知行为的影响及其作用机制研究

张建斌1,李小慧2

(1.长治医学院附属和济医院 神经内科，山西 长治 046011；2.长治医学院附属和济医院 神经康复科，山西 长治 046000)

目的 探讨石榴汁对慢性脑低灌注大鼠认知行为的影响及其作用机制。方法 选取48只健康雄性Wistar大鼠，随机分为3组，假手术组(sham operation，SO)、大鼠双侧颈总动脉持久性结扎 (permanent bilateral commancarotid artery occlusion or two-vessel occlusion, 2VO)组、石榴汁组。采用永久性双侧颈总动脉结扎术制备慢性脑低灌注大鼠模型。术后1周开始给予干预，前2组用糖水灌胃(每100 mL糖水含蔗糖25 g，葡萄糖2 g，果糖2 g)，石榴汁组用石榴汁(多酚含量2.4～4.8 mg/mL)灌胃，均2 mL/d，共7周。术后第8周用Morris水迷宫检测3组大鼠在学习方面的认知行为能力，连续检测5 d；间隔1 d后用空间探索试验的目标象限游泳时间检测3组大鼠记忆方面的认知行为能力；用免疫组织化学方法检测3组大鼠皮层及海马CA1区8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2 deoxyguanosine，8-OHDG)、4-羟壬烯醛(4-hydroxynonenal, 4-HNE)的表达；观察石榴汁是否能改善慢性脑低灌注大鼠学习、记忆能力的作用，是否具有抗氧化应激损伤作用。结果 在第4天和第5天，假手术组大鼠找到平台时间最短，2VO组时间最长,3组间比较差异有统计学意义(P<0.01)；3组大鼠在目标象限出现时间假手术组最长(10.05±1.688) s，2VO组时间最短(6.343±1.220)s，且差异有统计学意义(P<0.05) 。3组大鼠皮质与海马CA1区4HNE、8-OHdG的阳性细胞的积分光密度值(integral optical density，IOD)以假手术组最低， 2VO组最高，差异有统计学意义(P<0.05)。石榴汁干预后，大鼠的皮质与海马CA1区的8-OHdG、4-HNE的表达明显减少(P<0.05)。结论 慢性脑低灌注可以引起氧化应激性损伤，石榴汁可以改善慢性脑低灌大鼠的学习与记忆能力，减少8-OHdG和4-HNE表达，可能通过抗氧化应激途径发挥脑保护功能。

石榴汁；慢性脑低灌注；氧化应激；认知障碍

目前，随着全球老龄化程度不断加深，我国老年人数的急剧攀升，并在人民生活水平提高和生活方式改变的基础上，脑血管病的危险因素，如高血脂、高血粘度和糖尿病等，使得脑血管病的发病率及病死率居高不下，给国家和家庭造成严重的经济负担，引起各国学者的重视[1]。脑血管病是神经系统疾病中发病率与致残率最高的一种疾病，其中以慢性脑低灌注(chronic cerebral hypoperfusion，CCH)为主，约为62.4%，多见于老年人群[2]。重视对其进行早期干预，防治认知功能的发生和发展，具有积极意义。石榴(PunicagranatumL.)属石榴科(Pumicaceae)石榴属(Punica L.)植物，石榴汁提取物能够有效地清除羟自由基和超氧阴离子自由基,抑制LDL和脂质过氧化,抑制动脉粥样硬化(AS)的形成,具有很强的抗氧化功能[3-5]。近年来，石榴广泛用于预防和治疗心血管疾病，现代医学证明，石榴汁总提取物比单个成分具有更强的生物活性，也说明石榴汁所具有的生物活性是十多个成分的化学协同作用[6]，本研究旨在探讨石榴汁对慢性脑低灌注的大鼠认知行为的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性Wistar大鼠40只，鼠龄8～10周，体质量220～250 g， 购自北京大坪医院野战外科研究所动物中心，合格证号：SCXK(渝)20140015 ，本实验操作严格遵守《实验动物保护条例》。

1.2 药品与试剂 石榴购自于陕西临潼；4-羟基壬烯醛(4-HNE)兔多克隆抗体购自美国Alpha Diagnostic Intemational公司；辣根酶标记山抗兔IgG购自美国Sigma公司；ECL Plus显色试剂盒购自美国安玛西亚公司；Folin—Ciocalteu试剂盒购自上海荔达生物科技有限公司；丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒购自南京建成生物工程公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.3 主要仪器 Morris 水迷宫系统(美国Beckman公司)，电子天平(AE200型，瑞典梅特勒-托利多仪器有限公司)，凝胶图像处理系统(日本OLMPUS公司)，PCR酶标仪(深圳天南海北实业有限公司)

1.4 实验方法

1.4.1 石榴汁的制备：石榴洗净去皮，带无菌手套，经无菌纱布压汁，低温离心，低温真空浓缩器蒸发，冷却，混合均匀分装消毒管中，-20 ℃保存。

1.4.2 动物分组及造模给药：48只健康雄性Wistar大鼠采用随机数字的方法将其随机分为3组，假手术(sham operation，SO)组，大鼠双侧颈总动脉持久性结扎 (permanent bilateral commancarotid artery occlusion or two-vessel occlusion, 2VO)组、石榴汁组。采用永久性双侧颈总动脉结扎术制备慢性脑低灌注模型。术后1周开始给予干预，SO组和2VO组用糖水灌胃(每100 mL糖水含蔗糖25 g，葡萄糖2 g，果糖2 g)，石榴汁组用石榴汁(多酚含量2.4～4.8 mg/mL)灌胃，均2 mL/d，共7周。术后第8周用Morris水迷宫检测3组大鼠在学习方面的认知行为能力，连续检测5 d；间隔1 d后用空间探索试验的目标象限游泳时间检测3组大鼠记忆方面的认知行为能力;用免疫组织化学方法检测3组大鼠皮层及海马CA1区8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)、4-羟壬烯醛(4-HNE)的表达；观察石榴汁是否能改善慢性脑低灌注大鼠学习、记忆能力的作用，是否具有抗氧化应激损伤作用。

1.4.3 水迷宫实验[7]：①定位航行试验测定逃避潜伏期，其实验步骤为：实验前1周将大鼠头颈部染成黄色，水迷宫为一圆形水池，其大小水深等固定，且在池壁上等距离分别依次标记四个方向: 东(E)、 南(S)、西(W)、北(N) ，在ES象限(第四象限) 正中离池壁30 cm处放一个圆形平台，平台直径为10 cm，高30 cm水池上方安有摄像头，图像经视频输入计算机，大鼠的运动轨迹被同步记录。连续训练3 d，每天训练2次，每次随机在NW、W、SW和E方向中选择一个作为入水点，观察并记录大鼠爬上平台的轨迹图及所需时间(定位航行潜伏期) ，如果大鼠在120 s内找不到平台，则将大鼠引至平台并在平台上停留20 s，第4天去除平台，选择N 作为入水点观察并记录大鼠的游泳速度以及第四象限的游泳时间(空间探索时间) ，每只大鼠检测1次。

2 结果

2.1 水迷宫实验

2.1.1 逃离潜伏期试验结果：经过两因素方差分析(3×5)得出组和组之间的Morris水迷宫平均潜伏期时间有显著性差异(F2，100=250.95，P<0.01)，各组的组内经过5 d训练，得到的Morris水迷宫平均潜伏期也有统计学差异(F4，100=56.03，P<0.01)；用LSD检验，结果显示在训练期的第4天和第5天，2VO组大鼠找到平台的时间显著多于假手术组，差异有统计学意义(P<0.01)，而给予石榴汁干预组的大鼠找到平台的时间显著少于2VO对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 石榴汁对慢性脑低灌注大鼠空间学习记忆的比较*P<0.05，与2VO组相比；△P<0.05，与假手术组相比Fig.1 Comparison of pomegranate juice on learning and memory spacein rats with chronic cerebral hypoperfusion*P<0.05，compared with 2VO group；△P<0.05，compared with SO group

2.1.2 空间探索试验结果：2VO 组大鼠在目标象限出现的游泳时间为(6.343±1.220)s，显著低于假手术组的时间(10.050±1.688)s，这2组之间的差异有统计学意义(P<0.01)。在用石榴汁灌胃干预后，可以明显增加大鼠在目标象限出现的游泳时间(8.950±2.371)s，而与2VO加用糖水灌胃处理的对照组时间为(6.343±1.220)s，这2组之间的比较，其差异具有统计学意义 (P<0.05)。见表1。

表1 3组大鼠空间记忆认知能力的比较±s)Tab.1 Comparison of spatial memory in rats of cognitive ability among three ±s)

*P<0.05，与2VO比较， compared with 2VO group；△P<0.05，与假手术组比较，compared with SO group

2.2 石榴汁对慢性脑低灌注大鼠8-OHdG 的影响

2.2.1 3组大鼠皮质8-OHdG 的表达与统计分析：3组大鼠皮质8-OHdG的IOD均值分别是假手术组(1788.82±183.01)、石榴汁组(4130.40±213.55)、2VO组(11515.34±921.73)。输出结果显示：经石榴汁干预后，大鼠的皮质8-OHdG 的表达明显减少。经方差分析LSD法得到结果：各组之间的8-OHdG 皮质含量具有差异性(P<0.05)，且可以得出8-OHdG皮质在大鼠皮质的表达含量为：假手术组<石榴汁组<2VO组；说明石榴汁可以减少大鼠皮质区8-OHdG的表达，可以降低慢性脑低灌注损大鼠的氧化应激损伤，具有良好的抗氧化作用。见表2。

表2 3组大鼠皮质8-OHdG方差分析Tab.2 Analysis of variance of 8-OHdG in cerebral cortex region among three groups

*The mean difference is significant at the 0 .05 level.

2.2.2 3组大鼠海马CA1 区8-OHdG 的表达与统计分析:3组大鼠海马CA1区8-OHdG的IOD均值分别是假手术组(655.67±151.28)、石榴汁组(1665.86±57.15)、2VO组(2776.47±188.10)。输出结果显示：经石榴汁干预后，大鼠的海马CA1区8-OHdG的表达明显减少。经方差分析LSD法得到结果：各组之间的8-OHdG海马CA1区含量具有差异性(P<0.05)，且可以看出8-OHdG海马CA1区的表达含量为：假手术组<石榴汁组<2VO 组；说明石榴汁可以减少海马CA1区8-OHdG的表达，可以降低慢性脑低灌注损大鼠的氧化应激损伤，具有良好的抗氧化作用。见表3。

表3 3组大鼠海马CA1 区8-OHdG的方差分析Tab.3 Analysis of variance of 8-OHdG in hippocampus CA1 region among three groups

*The mean difference is significant at the 0 .05 level.

2.3 石榴汁对慢性脑低灌注大鼠4-HNE影响

2.3.1 3组大鼠皮质4HNE 的表达与统计分析 3组大鼠皮质的4-HNE IOD均值分别是：假手术组(1459.47±233.57)、石榴汁组(3150.87±173.64)、2VO 组(8695.24±326.58)。输出结果显示：经石榴汁干预后，大鼠的皮质4-HNE 的表达明显减少。经方差分析LSD法得到结果：P值均小于0.05，各组之间的4-HNE 皮质含量具有差异性，且可以看出4-HNE皮质的表达含量为假手术组<石榴汁组<2VO 组；说明石榴汁可以减少大鼠皮质区4-HNE 的表达，可以降低慢性脑低灌注损大鼠的氧化应激损伤，具有良好的抗氧化作用，见表4。

表4 3组大鼠皮质的4-HNE 方差分析Tab.4 Analysis of variance of 4-HNE in cerebral cortex region among three groups

*The mean difference is significant at the 0.05 level.

2.3.2 3组大鼠海马CA1 区4-HNE 的表达与统计分析 3组大鼠海马CA1的4-HNE IOD均值分别是假手术组(442.22±62.98)、石榴汁组(1501.96±252.77)、2VO组(2546.31±430.74)。输出结果显示：经石榴汁干预后，大鼠的大脑海马CA1区4-HNE的表达明显减少。经方差分析LSD法得到结果：P值均小于0.05，各组之间的4-HNE 海马CA1区含量具有差异性，且可以得出海马CA1区的4-HNE表达数量为：假手术组<石榴汁组<2VO组；说明石榴汁可以减少海马CA1区4-HNE 的表达，具有良好的抗氧化作用，见表5。

表5 3组大鼠海马CA1 区4-HNE的结果分析Tab.5 Analysis of variance of 4-HNE in hippocampus CA1 region among three groups

*The mean difference is significant at the 0.05 level.

3 结论

慢性脑低灌注与氧化应激有关，氧化应激已被广泛研究证实是导致神经细胞缺血性损伤的重要致病原因之一[8]。机体内大量的活性氧物质的产生，可引起一系列氧化性生物效应。

氧化中枢神经细胞膜的脂质成份，产生氧化反应，使神经细胞 DNA 分子产生剪切，使蛋白质氧化裂解，产生羰基衍生物及硝化酪氨酸等有毒性作用的物质。另外，活性氧物质还可使线粒体产生氧化性病理损伤[9-10]，使线粒体功能下降，体内三磷酸腺苷(ATP)合成减少，导致中枢神经细胞能量缺乏，产生病理性氧化损伤。中枢神经细胞膜脂质、DNA、蛋白质及线粒体受氧化应激损伤后产生的副产物，如过氧化物、乙醇、乙醛、甲酮和胆固醇氧化物等，都会对机体的正常细胞产生不同程度的毒害作用[11]。有资料表明氧化应激在脑血管低灌注过程中发挥重要致病作用。脑低灌注患者易感神经元的细胞质易发生氧化性损伤，8-羟鸟苷酸常作为核酸的氧化损伤的标志物[12]，目前多运用于脑低灌注模型的氧化性应激损伤的实验研究。本实验中模型组CA1 区8-OhdG的表达最高，与理论研究结果相一致，而石榴汁治疗以后有所降低，证实石榴汁可以使大鼠的海马CA1 区8-OHdG 的表达明显减少，说明是石榴汁通过降低大脑氧化损伤而改变大脑低灌注。

有研究发现[13-15]，氧化应激条件下大量的氧自由基可使神经元产生脂质过氧化，产生大量的脂质过氧化产物——4-羟基壬烯醛(HNE)，后者可诱导神经细胞的凋亡，血管性痴呆模型大鼠的认知能力下降。在本实验中，模型组中海马CA1 区4-HNE 的表达最高，而石榴汁治疗海马CA1 区4-HNE明显减少，且有统计学意义(P<0.05)。说明石榴汁通过减少氧化损伤而降低对大脑低灌注的影响。在本研究中，由于海马CA1 区4-HNE和8-OhdG增加，而导致大鼠的认知力下降。目前临床多用抗氧化剂来抑制神经细胞的脂质过氧化，达到保护神经细胞，改善细胞功能，减轻氧化性脑损伤的目的。

综上所述，石榴汁可以改善慢性脑低灌注大鼠的认知行为功能，其机制可能是通过降低抗氧化应激代谢产物——4-HNE和8-OhdG改变，而改善大脑低灌注。

[1] 吴兆苏，姚崇华，赵冬.我国人群脑卒中发病率、死亡率的流行病学研究[J].中华流行病学杂志，2003，24(3)：236-239.

[2] Zhong LF, Yang J, Hong Z,et al.Proportion of different subtypes of stoke in china[J].Stoke, 2003,34(10):2091-2096.

[3] Ferri CP,Prince M,Brayne C,et al.Global prevalence of dementia：a delphi consensus study[J].Lancet,2005, 366 (3): 2112-2117.

[4] Petersen RC,Smith GE,Waring SC,et al.Mild cognitive impairment: clinical characterization and outcome[J].Arch Neurol,1999,56(3):303-308.

[5] Yamada1 M,Ihara1 M,Okamoto Y,et al.The influence of chronic cerebral hypoperfusion on cognitive function and amyloid metabolism in APP overexpressing mice[J].Plos One,2011, 6(1):1-9.

[6] Cacciari C,Moraschi M,Paola MD,et al.White matter microstructure and apathy level in amnestic mild cognitive impairment[J].J Alzheimer Dis, 20(2):501-507.

[7] Deschaintre Y,Richard F,Leys D,et al.Treatment of vascular risk factors is associated with slower decline in Alzheimer disease[J].Neurology,2009,73 (18):674-680.

[8] Juranek I,Bezek S.Controversy of free radical hypothesis:reactive oxygen species-cause or consequence of tissue injury?[J].Gen Physiol Biophys,2005,24(3):263-227.

[9] David C.Christiani.Association between fine particulate matter and oxidative DNA damage may be modified in individuals with hypertension[J].J Occup Environ Med,2009,51(10):1158-1166.

[10] Susanne U.Absorption, metabolism, and antioxidant effects of pomegranate (Punica granatum L) polyphenols after ingestion of a standardized extract in healthy human volunteers[J].J Agric Food Chem,2006,21(5):8956-8961.

[11] Park L, Anrather J,Girouard H,et al.Nox2-derived reactive oxygen species mediate neurovascular dysregulation in the aging mouse brains[J].J Cereb Blood Flow Metab,2007,27(12), 1908-1918.

[12] Ohta H, Nishikawa H, Kimura H, et al.Chronic cerebral hypoperfusion by permanent internal carotid ligation produces learning impairment without brain damage in rats[J].Neuroscience, 1997,79 (21):1039-1050.

[13] Miki K,Ishibash S,Sun L.Intensity of Chronic Cerebral Hypoperfusion Determines White/Gray Matter Injury and Cognitive/Motor Dysfunction in Mice[J].J Neurosci Res,2009，87 (19):1270-1281.

[14] Bournival J,Quessy P,Martinoli MG.Protective effects of resveratrol and quercetin against MPP+induced oxidative stress act by modulating markers of apoptotic death in dopaminergic neurons[J].Cell Mol Neurobiol,2009,29(8):1169-1180.

[15] Sargis RM,Subbaiah PV.Protection of membrane eholesterol by sphingomyelin against free radical—mediated oxidation[J].Free Radic Biol Med,2006,40(12):2092-2102.

(编校：王冬梅)

Study of influence of chronic cerebral hypoperfusion on cognitive function and mechanisms in rats of pomegranate juice

ZHANG Jian-bin1,LI Xiao-hui2

(1.Department of Neurology, Heji Hospital, Affiliated Hospital of Changzhi Medical College,Changzhi 046011, China; 2.Department of Neurological Rehabilitation, Heji Hospital, Affiliated Hospital of Changzhi Medical College, Changzhi 046000, China)

ObjectiveTo explore the influence of pomegranate juice on cognitive behavior of chroniccerebral hypoperfusion in rats and its mechanism.Methods48 healthy male Wistar rats were selected and randomly divided into 3 groups, sham operation group (SO), permanent bilateral persistence commancarotid artery occlusion or two-vesselocclusion (2VO) group, pomegranate juice group. Chronic cerebral hypoperfusion model was prepared in rats by permanent bilateral common carotid artery ligation. Given the intervention after operation 1 weeks, before the 2 groups were given by sugar water intragastric (every 100 mL syrup containing 25 g,sucrose 2 g, fructose glucose 2 g) with pomegranate juice, pomegranate juice group (polyphenol content of 2.4-4.8 mg/mL) were given by gavage,2 mL/d, a total of 7 weeks. 8 th weeks after surgery, cognitive behavior ability of 3 groups was tested by space exploration target quadrant swimming time after an interval of 1day ; CA1 region of 8-hydroxy deoxyguanosine (8-OHdG), 4- hydroxyl nonenal (4-HNE)expression of 3 groups in cortex and hippocampus detected by immunohistochemical method; observed whether it could improve the chronic cerebral hypoperfusion in rats learning, memory ability, or had antioxidative stress injury. ResultsOn the 4th day and 5th day, the time of rats in SO to find the platform and the shortest time, group 2VO for the longest time, compared with statistical significance between the three groups (P<0.01); the 3 groups of rats in the target quadrant emergence time in sham operation group, the longest (10.05+1.688)s, 2VO group has the shortest time (6.343±1.220) s, and there was statistical significance (P<0.05). The integral optical density of positive cells in 3 groups of rats cortex and hippocampal CA1 region of 4HNE, the value of the 8-OHdG IOD is the lowest in the sham operation group, 2VO group was the highest, with statistical significance. Pomegranate juice intervention, cortex of rats and hippocampal CA1 region of 8-OHdG, 4-HNE decreased significantly(P<0.05).ConclusionChronic cerebral hypoperfusion may cause oxidative stress injury, pomegranate juice can improve the low irrigation learning and memory ability of rats with chronic cerebral, decrease 8-OHdG and 4-HNE expression may play a protective function through antioxidative stress pathway.

pomegranate juice; chronic cerebral hypoperiusion;oxidative stress; cognitive impairment

山西省高校科技项目(200713024)

张建斌，男，硕士，副教授，研究方向：脑血管病的诊断和治疗，E-mail：zhangjb0122@sina.com。

R749.1

A

1005-1678(2015)03-0058-04