骨保护素对破骨细胞的影响程度分析

刘建,宋晖

(1.山东东营市胜利油田医院 骨科，山东 东营 257000；2.山东大学，山东 济南 250000)



骨保护素对破骨细胞的影响程度分析

刘建1,宋晖2

(1.山东东营市胜利油田医院 骨科，山东 东营 257000；2.山东大学，山东 济南 250000)

目的 通过分析比较不同浓度的骨保护素(osteoprotegerin，OPG)对破骨细胞(osteoclasts，OC)活性的影响程度来研究2者在生理活性及生理功能之间的相关性。方法 应用6周龄的雌性小鼠，取骨髓细胞体外培养，添加不同浓度的骨保护素(10、20、50、100 μg/L)后通过抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)染色、细胞骨架F-actin染色及骨吸收陷窝的检测，观察OPG与OC之间的相关性。结果 OC培养1 h内即贴壁生长，并为展开且无大的多核OC存在。培养至第5天，较小的单核细胞逐渐开始相互融合，形成多核细胞且特征明显。OPG处理3 d后，随着OPG 浓度的增大，实验组多核细胞数随着骨保护素(OPG)浓度的逐渐增加而减少，2者呈现负相关(r=-0.516，P<0.05)，且OPG浓度为50 μg/L时仅有少量多核细胞可见。OPG的浓度为20、50 μg/L时，OPG组的OC数较对照组显著减少(P<0.05)，而当OPG的浓度为100 μg/L时，OPG组的OC数较对照组呈极显著减少(P<0.01)。OPG实验组的骨吸收陷窝的面积、密度和减弱程度均与OPG的浓度呈正相关(r=0.459；r=0.426；r=0.389，均P<0.05)，且OPG各浓度组骨吸收陷窝面积与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 不同浓度的OPG对破骨细胞功能及活性的影响程度不同，且OPG的浓度越大其抑制性越强。

骨保护素；破骨细胞；吸收陷窝

破骨细胞(osteoclasts，OC)来源于特定的破骨前体(osteoclast precursors，OCPs)，在骨吸收功能中维持至骨代谢平衡，且与全身或局部性的骨质疏松密切相关[1]。研究表明[2]，骨营养不良的最主要原因为骨吸收程度大于骨在建程度，这也间接说明了破骨细胞对骨质的影响较大。此外，OC活性的异常变化可对机体骨骼产生不同程度的病理性变化，如骨质疏松等。近些年发现[3]OPG可以通过OPG/RANK/RANKL机制抑制OC的分化、活化成熟并诱导OC的凋亡，且有望成为治疗多种骨代谢疾病的理想药物。但当前国内外对于骨保护素与破骨细胞之间的活化影响成对的报道较少，且其中关于活化和生成的机理尚不明确。故本试验通过对不同浓度的骨保护素对破骨细胞的生成和活化程度的影响来研究两者在生理活性及生理功能之间的相关性。

1 材料与方法

1.1 主要实验仪器与试剂 超净工作台(北京精密仪器厂)；PS-9000705超纯水装置(美国 LABCONCO 公司)；CO2温培养箱(Heraeus公司)；倒置相差显微镜(Olympus公司：IX 7000) ；扫描电子显微镜(日电，JEOL JSM-T300)。抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)染色试剂盒购自美国Sigma公司；α-MEM(Gibco)；胎牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司)；1600锯式切片机(Leica)；12、48孔培养板(兴万Corning)；牛皮质骨片(直径50 μm，IDS)；骨保护素(PeproTech Inc.USA)。

1.2 OC分离与培养 OC分离在参考付应宵[4]的分离方法上做出一定的改进。本实验选取6周龄的雌性ICR小鼠，使其脱颈窒息而死，将小鼠的前肢肱骨及后肢长骨在无菌环境下进行分割分离，取骨髓细胞并于200 g/min下离心5 min，取沉淀物。重悬于含α-MEM的培养液中(含2 mmol/L L-谷氨酰胺，10%FBS、100 IU/mL青霉素、100 mg/L链霉素)，按操作规程要求将其分别接种于12孔培养板和48孔培养板，其中在48孔板中部分放置牛骨片，同时在5%CO2饱和湿度的环境下培养24 h。贴壁细胞用37 ℃含0.05%吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液反复冲洗，继续培养，每天更新培养液。如此反复操作3 d。第4天，其中对照组加入0 μg/L的OPG，实验组加入10、20、50和100 μg/L的OPG，按上述条件继续培养3 d后，进行检测。

1.3 染色处理 经骨保护素(OPG)处理3 d后，将细胞培养板取出，用含0.05%吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液冲洗3次，然后以4%多聚甲醛固定10 min，使用TRAP试剂盒进行检测。将玻片取出，用枸橼酸/Acetone溶液进行固定后进行染色，使其在37 ℃的环境下孵育60 min，清洗、晾干、封片，倒置显微镜观察。

培养结束后，取出细胞培养板，再次以含0.05%吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液冲洗3次，4%多聚甲醛固定10 min，含0.05%吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液冲洗3次，0.1% triton X-100透膜处理5 min，含0.05%吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液冲洗3次，1%牛血清白蛋白封闭30 min。严格按照说明书用Phalloidin-TRITC(50 mg/L)进行染色，在37 ℃的环境温度下避光孵育20 min，含0.05%吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液反复冲洗，荧光显微镜观察。

1.4 牛皮质骨片吸收陷窝检测 将牛皮质骨片加入48孔培养板中，与细胞共同培养8天。将玻片取出，以含0.05%吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液冲洗3次，用0.25 mol/L的NH3·H2O溶液超声清洗3次，每次5 min，保证其可以将吸收陷窝被完全暴露出来。细胞被完全清除后，乙醇梯度脱水，丙酮置换，CO2临界点干燥，离子喷镀仪喷镀镀金。扫描电子显微镜观察。

2 结果

2.1 OC形态学观察 OC培养1h内即贴壁生长，为展开且无大的多核OC存在。OPG处理2d后，较小的单核细胞逐渐开始相互融合，形成多核细胞且特征明显。OPG处理3 d后，见图1。对照组细胞形态整体良好，实验组多核细胞数随着骨保护素(OPG)浓度的逐渐增加而减少，2者间呈现负相关(r=-0.516，P<0.05)。且当骨保护素(OPG)浓度为50 μg/L 时，视野内仅存在少量多核细胞。

图1 OC形态学观察(×100) a.对照组；b.10 μg/L OPG；c.20 μg/L OPG；d.50 μg/L OPG；e.100 μg/L OPGFig.1 OC morphology(×100)a.control group; b.10 μg/L OPG; c.20 μg/L OPG；d.50 μg/L OPG；e.100 μg/L OPG

2.2 OC染色结果 培养结束后，将玻片取出，严格按照试剂盒所述步骤进行TRAP染色，各组均可见TRAP染色阳性细胞，主要为多核细胞且体积较大，部分细胞胞质内有红色的阳性颗粒及棕红色沉淀。对阳性多核细胞进行计数分析，结果显示，OC细胞数随着OPG浓度的增大而逐渐减少。且同对照组相比，当OPG的浓度为10 μg/L时，2组OC细胞数无统计学差异，当OPG的浓度为20、50 μg/L时，OPG组的OC数显著减少(P<0.05)，而当OPG的浓度为100 μg/L时，OPG组的OC数呈极显著减少(P<0.01)。见图2、图3。

图2 TRAP染色阳性 OC(×100)Fig.2 Osteoclasts stained with TRAP(×100)

图3 OPG浓度对小鼠OC数量的影响结果(×400)*P<0.05，**P<0.05，与对照组比较Fig.3 Effect of OPG concentration on the number of OC in mice results(×400)*P<0.05，**P<0.05，compared with control group

严格按照说明书用Phalloidin-TRITC进行染色，结果表明，实验组破骨细胞(OC)内细胞骨架F-actin均匀弥散分布着丝状物；而对照组细胞骨架F-actin多为形状规则，边界清晰且数目较多。F-actin环数目随着骨保护素(OPG)浓度的增加而呈现出剂量依赖性减少，环的轮廓模糊不清，甚至出现裂环现象，见图4。

图4 OPG对小鼠OC内F-actin环的影响(×400)a.对照组；b.10 μg/L OPG；c.20 μg/L OPG；d.50 μg/L OPG；e.100 μg/L OPGFig.4 Effects of OPG on the mouse OC F-actin ring (×400)a.control group；b.10 μg/L OPG；c.20 μg/L OPG；d.50 μg/L OPG；e.100 μg/L OPG

2.3 骨吸收陷窝面积的计算 牛皮质骨片经培养后发现，对照组存在明显的骨吸收陷窝，陷窝长度约为5～80 μm，较深。经Spearman等级相关分析表明，OPG实验组的骨吸收陷窝的面积、密度和减弱程度均与其OPG的浓度呈正相关(r=0.459；r=0.426；r=0.389，均P<0.05)，且OPG各浓度组骨吸收陷窝面积与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)，见图5。

图5 OPG对小鼠OC骨吸收功能的影响*P<0.05，**P<0.01，与对照组比较Fig.5 Effect of OPG on mouse OC resorption*P<0.05，**P<0.01，compared with control group

3 讨论

骨保护素(OPG)是一种可溶性分泌型糖蛋白，可以作为假受体与RANK竞争性的结合RANKL，从而阻断OC的分化、成熟并诱导其凋来抑制OC的骨吸收功能。研究表明，敲除了OPG基因的小鼠会出现严重的骨质疏松等现象，但是转OPG基因鼠的骨密度却呈现升高的趋势，故OPG类代表药已于2012年被批准使用[5]。近些年发现，OPG不仅影响着骨骼的吸收，同时与免疫系统、心血管系统等方面息息相关，如徐高阳[6]研究的OPG与动脉粥样硬化之间的关系，在OPG的研究领域中，这为今后的研究提供了一个全新的研究角度。

OC 是一种终末分化的多核巨细胞且与单核细胞来源相同，其生成受到核因子和巨噬细胞集落刺激因子的调控。就目前的研究状况而言，国内外均无成熟的具有OC特征的细胞株，所以对于OC的获得也仅依靠从组织中分离而获得这一主要途径。在本次研究中采用无菌分离前肢肱骨及两后肢长骨而取得骨髓细胞的技术，这样得到的细胞能保持其最高活性，其表现最接近人体生理指标。在破骨细胞的鉴定检测中，形态观察、TRAP染色、组织蛋白酶K的基因水平检测及骨磨片上骨吸收陷窝的形成能力为当前使用最为广泛的检测方式[7]。针对本研究选取形态观察、TRAP染色及骨片吸收陷窝形成这3种手段对离体的OC进行鉴定分析。

近些年，在OC的鉴别中，通常采用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)作为OC的特异性酶对其进行组织鉴别[7]。本次实验也选用这种方法，实验结果显示此鉴别方法简便、可靠。在细胞骨架中，微丝在细胞的形态维持、发生运动和分裂分化中起重要作用[8]。在微丝的组织结构分析中，Actin为其基础蛋白，能够较好地反映微丝的结构形态，且F-actin为细胞骨架的重要部分[9]。在本次实验中，细胞骨架F-actin多为形状规则，边界清晰且数目较多，与张红菊[10]的报道结果一致，说明本次实验所选的染色检测手段适用于对OC的研究。

在OC的体外培养中，数量少、纯度低、不能传代一直是制约其广泛研究的重要问题[11-14]。在实验研究中，原代分离的OC具有更好的生物学特性，能更好地保持其生理活性，更准确地反映机体的生理变化。在本次实验中，尽量保持其细胞的纯度，通过TRAP染色、F-actin染色及骨吸收陷窝的鉴定等技术手段，确定本次分离得到了典型的小鼠OC。

综上所述，不同浓度的骨保护素(OPG)对破骨细胞(OC)的活性的影响程度不同，当OPG的浓度为20、50 μg/L时，OPG组的OC数显著减少(P<0.05)，而当OPG的浓度为100 μg/L时，OPG组的OC数呈极显著减少(P<0.01)。所以，不同浓度的OPG对破骨细胞的影响程度不同，且OPG的浓度越大，其抑制性越强。

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(编校：谭玲，王俨俨)

Effect of osteoprotegerin on osteoclasts

LIU Jian1,SONG Hui2

(1.Department of Orthopedics, Shandong Hospital of Shengli Oil Field of Dongying City, Dongying 257000, China; 2.Shandong University, Ji’nan 250000，China)

ObjectiveTo analyse the effects of OPG (osteoprotegerin, OPG) at different concentrations on activity of osteoclasts (osteoclasts, OC), and the relationship between them in physiological activity and function.MethodsThe bone marrow cells of six weeks old female mice were collected and cultured in vitro on the basis of adding different levels of OPG(10, 20, 50, 100 μg/L).The relationship between OPG and OC were analysed by tartrate resistant acid phosphatase (TRAP) staining, F-actin cytoskeleton staining and bone resorption pits.ResultsOC showed adherent growth within 1h cultured, and there were no large multicore OC.Cultured for 5 days, the smaller monocytes gradually began to fusion with each other to form multinucleated cells and showed distinctive characteristics.After three days OPG treatment, the number of multicore cells gradually reduced with OPG concentration increaseing in experimental group, and showing a negative correlation between them(r=-0.516，P<0.05).And there were only a small amount of multinucleated cells at OPG concentration of 50 μg/L.At 20,50 μg/L of OPG concentration, OC number significantly decreased compared with control group (P<0.05), and when the concentration of OPG was 100 μg/L, OC number showed significant reduction (P<0 01).the experimental group OPG bone resorption lacunae area, density and decrease the degree were positively correlated with concentration of OPG (r=0.459；r=0.426；r=0.389，P<0.05), and the area had a significant difference when two groups compared.ConclusionThe inhibitive effects of OPG on OC function and activation increase with concentration increasing.

osteoprotegerin; osteoclasts ;resorption pits

2008年山东省自然科学基金(Y2008C99)

刘建，男，本科，副主任医师，研究方向：骨科关节及相关性疾病，E-mail：LJ13905469304@163.com。

R3

A

1005-1678(2015)03-0065-04