抗黑色素瘤药物异甘草素对酪氨酸酶抑制机理的研究

庞得全,王英曼,郑维国,戴云飞

(1.河北联合大学附属医院 放疗科，河北 唐山 063000；2.河北联合大学附属医院 血液科，河北 唐山 063000；3．河北联合大学附属医院 急诊科，河北 唐山 063000)



抗黑色素瘤药物异甘草素对酪氨酸酶抑制机理的研究

庞得全1,王英曼2,郑维国3,戴云飞1

(1.河北联合大学附属医院 放疗科，河北 唐山 063000；2.河北联合大学附属医院 血液科，河北 唐山 063000；3．河北联合大学附属医院 急诊科，河北 唐山 063000)

目的 探讨黑色素瘤药物异甘草素对酪氨酸酶的抑制作用机理。方法 采用酶抑制动力学方法，研究异甘草素对酪氨酸酶单酚酶和二酚酶的抑制作用和抑制动力学，研究甘草素对黑色素瘤细胞A375生长的抑制作用。结果 异甘草素对单酚酶和二酚酶都有良好的抑制作用，IC50分别为(11.22±0.92) μM和(48.53±4.75) μM，且异甘草素是一种可逆的竞争型酪氨酸酶二酚酶抑制剂，抑制常数Ki为(12.14±0.54) μM。异甘草素能显著抑制黑色素瘤细胞A375的生长，酪氨酸酶活性和黑色素含量不断降低。结论 异甘草素是良好的酪氨酸酶抑制剂，能抑制黑色素瘤细胞的生长。

异甘草素；酪氨酸酶；黑色素瘤；抑制

酪氨酸酶(EC 1.14.18.1)是一种结构复杂的多亚基的含铜氧化还原酶[1]，广泛存在于动植物体，是动植物体酶促褐变、体内色素合成的关键酶和限速酶[2]；它具有单酚酶的活性，能将酪氨酸羟化，产生L-多巴(邻位二羟基苯丙氨酸)，也具有二酚酶的活性，能将L-多巴氧化成多巴醌，多巴醌很不稳定，可以经一系列的非酶促反应后，形成黑色素(5,6-二羟吲哚和5,6-二羟吲哚-2-羧酸单元构成的异聚体)[3]；但当人体酪氨酸酶的活性过度表达的，则容易引发雀斑、黄褐斑、老年斑以及黑色素瘤等。

异甘草素(isoliquiritigenin)属于异黄酮类化合物，大量存在于豆科植物甘草的根、豆芽、鹰嘴豆的幼苗、红芪、黄芪、滇黄精的根、串果藤、香殊兰的球茎等[4-8]。异甘草素具有较强的抗病毒、抗炎、抗血管生成、催眠等生物活性。抗肿瘤作用是近年来研究的热点。本研究旨在通过探讨异甘草素对酪氨酸酶的抑制机理，为其治疗皮肤癌提供参考。

1 材料与方法

1.1 细胞株 人恶性黑色素瘤细胞株A375来自上海中科院细胞生化所。

1.2 试剂 MTT、Triton X-100 (美国Amresco公司)；RP-MI 1640培养基 (美国INVITROGEN 公司)；酪氨酸酶[3610 U/mg，来源于蘑菇，Sigma-aldrich(上海)贸易有限公司]；胎牛血清、异甘草素(分析纯)、左旋多巴(L-DOPA，分析纯)和L-酪氨酸(L-Tyr,分析纯，阿拉丁试剂(上海)有限公司)；缓冲体系为pH 6.8的磷酸盐 (50 mmol/L)。

1.3 实验仪器 UV-2450紫外-可见分光光度计(日本岛津公司)；Millipore Simplicity水纯化系统(法国密理博公司)；培养箱(力康生物医疗科技控股有限公司)；pHs-3C型酸度计(上海雷磁仪器厂)。

1.4 方法

1.4.1 酪氨酸酶单酚酶和二酚酶活性的测定:不同浓度异甘草素(0、50、100、250、200、250、300 μM)分别和酪氨酸酶单酚酶和二酚酶在37 ℃，磷酸盐缓冲体系中下孵化3 h，分别对应加入L-Tyr和L-DOPA，利用紫外-可见分光光度计的动力学/时间软件测定475 nm[9]处吸光值随时间的变化，并通过关系式：相对活性(%)=(R/R0)×100%，计算异甘草素对酪氨酸酶单酚酶和二酚酶的抑制活性；式中R0为无抑制剂时吸光度变化的斜率，R为在不同浓度异甘草素的体系中吸光度变化的斜率。曲酸为阳性对照。

1.4.2 异甘草素对酪氨酸酶二酚酶的抑制动力学研究：在上述实验条件下，固定酪氨酸酶二酚酶的浓度(2 μM)，测定不同异甘草素浓度(0、 5、10、50、100 μM)条件下，底物浓度对酶催化速率的影响，根据Lineweaver-Burk双倒数图，计算并评估异甘草素对酪氨酸酶二酚酶的抑制作用类型，最终求出抑制常数Ki。

1.4.3 异甘草素对人恶性黑色素瘤A375的生长抑制试验[10]：把不同浓度(0、50、100、150、200 μM)的异甘草素和人恶性黑色素瘤A375混合，在37 ℃，5%CO2中孵育48 h，之后加入0.5%的MTT染色液50 μL，继续孵育4 h后，2500 r/min，离心30 min，弃培养基，加入150 μL DMSO溶液，振荡器混匀后，测定570 nm处的吸光值(OD值)，计算细胞相对存活率。在加药培养48 h的细胞中，加入磷酸缓冲液和底物L-DOPA，于475 nm处测定黑色素瘤细胞中酪氨酸酶活性；加药培养48 h的细胞离心取上清，于475 nm处测定黑色素瘤细胞中黑色素生成量。

2 结果

2.1 异甘草素对酪氨酸酶的抑制作用 异甘草素的分子结构式见图1。

图1 异甘草素的分子结构式Fig.1 Structure of isoliquiritigenin

随着异甘草素浓度的增加(0～300 μM)，单酚酶(b)和二酚酶(a)的相对活性不断降低，当异甘草素浓度达到100 μM时，其对2种酶的抑制能力趋于平缓，解析其对单酚酶和二酚酶的半数抑制浓度(IC50)分别为(11.22±0.92) μM和(48.53±4.75) μM，见图2。图3为异甘草素对酪氨酸酶单酚酶的延滞时间结果，结合图2可知，随着异甘草素浓度的增加，单酚酶活力逐级下降，而迟滞时间稳步上升。

图2 异甘草素对酪氨酸酶单酚酶和二酚酶的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of isoliquiritigenin on monophenolase and diphenolase of tyrosinase

图3 异甘草素对酪氨酸酶单酚酶延滞时间作用Fig.3 The time delay effect of isoliquiritigenin on monophenolase of tyrosinase

2.2 异甘草素对酪氨酸酶二酚酶抑制动力学研究 为进一步验证异甘草素对酪氨酸酶二酚酶的抑制作用类型，分析异甘草素对酪氨酸酶二酚酶的抑制动力学，利用Lineweaver-Burk双倒数作方程，得出异甘草素对酪氨酸酶二酚酶的抑制作用类型为竞争型抑制作用[11]，并求得抑制常数Ki为(12.14±0.54) μM，见图4。

图4 异甘草素对酪氨酸酶二酚酶的抑制动力学双倒数曲线c(异甘草素)(μM), 从下向上1-5：0, 5, 10, 50, 100 μMFig.4 The inhibition of isoliquiritigenin on diphenolase of tyrosinase with the Lineweaver-Burk plot c(isoliquiritigenin)(μM), from 1 to 5 were 0, 5, 10, 50, 100 μM

2.3 异甘草素对人黑色素瘤细胞A375的影响 随着异甘草素浓度的不断增加，A375生长抑制不断地增强，A375细胞中的酪氨酸酶活性和黑色素含量不断降低，当异甘草素的浓度达到100 μM时，异甘草素对A375细胞的生长抑制作用趋于稳定，见图5。酪氨酸酶的抑制效果与体外实验结果一致，细胞合成黑色素的能力也呈现下降趋势，符合酶催化规律。

图5 异甘草素对人黑色素瘤细胞A375的生长抑制作用Fig.5 Effect of isoliquiritigenin on human melanoma A375 cell

3 讨论

恶性黑色素瘤是一种具有多发性、易转移的恶性程度极高的皮肤癌，到目前为止，并无有效的药物治疗，临床使用的药物仍是以化学合成药物为主，这些药物在对肿瘤细胞起到杀伤作用同时，也会对人体的正常细胞产生很大毒性，严重影响人体其他器官的正常生理代谢。因此筛选低毒性的天然活性成分作为抗癌药物，越来越受到人们的青睐。本文研究表明，异甘草素对人黑色素瘤细胞A375的生长起到抑制作用，且异甘草素对酪氨酸酶的抑制作用具有浓度依赖性。本研究结果还发现异甘草素能够使单酚酶稳定态活力逐级下降，迟滞时间稳步上升，这意味着异甘草素可以逐渐干扰酪氨酸与还原态酶的结合，使实验手段达到检测限的时间变长。

Lineweaver-Burk双倒数图显示异甘草素对酪氨酸酶二酸酶是典型的竞争性抑制剂，这表明异甘草素可能会结合到酪氨酸酶的Cu离子活性中心，和底物竞争活性位点，从而达到抑制的效果。国内外研究表明[9,12-14]，抑制剂对疾病有关的酶的抑制作用在呈现可逆的竞争性作用时，可以根据酶活性高低，通过有效控制抑制剂药物的剂量，来高选择性、可逆地降低酶的活性，而不是使酶彻底失活引起其他不良反应。在本研究中异甘草素是典型的竞争性抑制剂，这表明异甘草素可能会以非共价力，高选择性的结合到酶地活性中心，与底物可逆竞争活性位点，从而达到抑制效果。

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(编校：吴茜)

Study on inhibitory mechanism of anti-melanoma drug isoliquiritigenin on tyrosinase

PANG De-quan1, WANG Ying-man2, ZHENG Wei-guo3, DAI Yun-fei1

(1.Department of Radiotherapy, Hebei United University Affiliated Hospital, Tangshan 063000, China; 2.Department of Hematology, Hebei United University Affiliated Hospital,Tangshan 063000, China; 3.Department of Emergency, Hebei United University Affiliated Hospital, Tangshan 063000, China)

ObjectiveTo study the inhibitory mechanism of soliquiritigenin on tyrosinase.MethodsThe inhibition effect and inhibitory kinetics of tyrosinase induced by oliquiritigenin were investigated.The effect of isoliquiritigenin on A375 melanoma cell were preliminarily indicated.ResultsThe inhibitory effect of isoliquiritigenin on monophenolase and diphenolase of tyrosinase was good, IC50was (11.22±0.92) μM and (48.53±4.75) μM, isoliquiritigenin was a competitive inhibitor, the value of inhibition constant (Ki) was (12.14±0.54) μM.Isoliquiritigenin could inhibit the prolifevation of A375 cell significantly, and the tyrosinase activity and melanin synthesis decreased.ConclusionIsoliquiritigenin as a tyrosinase inhibitor, plays an important role in the regulation of melanin, which provides the theoretical basis for the clinical anti skin cancer.

isoliquiritigenin; tyrosinase; melanoma; inhibitory mechanism

河北省科技厅科研项目(112761175)，唐山市科技局指令性计划(12140209A-30)

庞得全，男，博士，副主任医师，研究方向：肿瘤放射治疗和综合治疗，E-mail：pangdequandoc@163.com。

R453.9

A

1005-1678(2015)03-0045-03