水稻香味基因分子标记的开发及应用

闫 影，诸光明，张丽霞，万常照，曹黎明，赵志鹏，吴书俊＊

（1 上海市农业科学院 作物育种栽培研究所，上海201403；2上海市嘉定区农业技术推广服务中心，上海201800）

随着当前城乡居民稻米消费水平的提高，高端优质大米市场开发的经济价值和市场前景日益受到关注。而香味作为评价优质米的一项重要指标，由于其在大米储藏和米饭蒸煮过程中散发出怡人香气，一直受到消费者的青睐，市场上的高档大米也大多为香米。长期以来，优质香味米品种的选育受到广泛重视。传统育种过程中鉴别水稻材料是否具有香味通常采用咀嚼法［1］或KOH 法［2］，这2 种方法主要依赖人的感官进行判定。如咀嚼法依靠味觉，咀嚼样品多时误差较大，而且香味以粒为单位分离，低世代单株上会出现既有香粒也有非香粒，鉴定结果难以准确可靠；KOH 法除了费时费工，且在鉴定叶片时易受强烈的叶绿素气味干扰，同样存在准确性差的问题。另外遗传研究表明，香味为单隐性质量性状，在杂交分离后代中，纯合香型单株或籽粒一般只占25%左右（香∶非香为1∶3），按传统检测方法易使一半含有香味基因的优良杂合个体在选择过程中被淘汰，不利于优良香型新品种的选育［3］。因此，如何准确、快速、简单地对香味进行鉴定一直是香稻育种中的难题之一。

研究表明，香稻含有多种挥发性化合物，而直接与水稻香味相关的挥发性物质为2－乙酰－1－吡咯啉（2－acetyl－1－pyrroline，2AP）［4－5］。由于甜菜碱醛脱氢酶基因Badh2功能的缺失会导致2AP前体物质的增加，从而积累2AP 使稻米产生香味［6］。自Bradbury等首先发现水稻第8染色体Badh2基因第7外显子8bp缺失及3bp突变产生无功能蛋白导致水稻香味以来，该基因序列已经有13处位点的变异被相继报道［7－8］。同时根据香味基因序列差异开发了一系列的分子标记，利用分子标记鉴定香味基因作为一种快速、准确、有效的手段已经开始应用于香稻分子育种。

王军等［9］针对第2外显子7bp和第7外显子8 bp缺失分别设计了检测香味基因的InDel标记In－Del－E2和InDel－E7。邵高能等［10］在香稻品种‘在妙香糯’中发现Badh2的等位基因在第4和5外显子之间共发生了803bp的缺失，并开发了可以检测该基因型的分子标记FMbadh2－E4－5。本研究针对Badh2基因第7外显子处同时存在8bp缺失及3 bp突变的序列特点利用扩增受阻突变体系PCR（ARMS，amplification refractory mutation system）技术进行等位基因特异扩增，开发了新的功能标记YY5－YY8。

本研究利用前面所述的2个分子标记InDel－E2和FMbadh2－E4－5，以及本实验开发的分子标记YY5－YY8，对80份来源广泛的香稻资源进行香味基因检测，旨在明确这些资源的香味基因突变类型，有助于科学、合理选择香稻资源开展优质香稻分子育种，大幅提高优质香稻育种效率。

1 材料和方法

1．1 水稻材料

本研究中80份香稻资源来源于中国不同生态区以及泰国、越南、日本等地，大致可分为三大类：粳稻、籼稻和糯稻（表1），同时以非香粳稻品种‘秀水123’为实验对照。所有水稻材料均于2013年夏季种植于上海市农业科学院庄行综合试验站，常规水肥管理。

1．2 分子标记

本实验所用3个分子标记InDel－E2、FMbadh2－E4－5和YY5－YY8分别是针对香味基因Badh2 在其第2、4、5、7外显子等3个主要变异区域相关碱基缺失或突变而设计，其中InDel－E2和FMbadh2－E4－5分别为王军等和邵高能等所开发，YY5－YY8为本研究所自主设计。各标记扩增产物大小及其引物序列见表2，引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。经过预备实验，该3个标记均表现反应体系稳定、实验重复性好、结果清晰可靠。

1．3 DNA 提取和PCR 扩增

利用CTAB 法提取水稻叶片全基因组DNA［11］。

反应体系20μL，包 含DNA模 板2．0μL，1 0mmol／L dNTP 0．4μL，25mmol／L MgCl21．6μL，10×Buffer 1．6μL，引物等体积混合液1．6μL，1 U／μLTaq酶0．2μL，加ddH2O 12．6μL。所用试剂均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

表1 本实验所用水稻材料Table 1 Rice varieties of this experiment

表2 本实验所用3个分子标记详细信息Table 2 Detailed information of three molecular markers in this experiment

反应程序为94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃～60℃退火30s，72℃复性30s，共33个循环；72℃延伸10min，10℃保存。

1．4 电泳检测

标记YY5－YY8和FMbadh2－E4－5的扩增产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，GelRed染料染色，利用凝胶成像系统观察结果；标记InDel－E2的扩增产物在6%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，银染后观察结果。

2 结果与分析

2．1 香味基因新功能标记开发

根据Badh2基因的克隆结果，针对第7外显子处8bp缺失和3bp突变，利用软件Prime premier 5．0设计该突变类型的功能标记YY5－YY8（图1）。

该标记由4 个序列组成，PCR 扩增时，外部上下游序列在香稻基因序列和非香稻基因序列中均可以在相应位置结合，而内部上游序列只与非香稻或是非本突变类型香稻基因序列相应位置结合，内部下游序列只与本突变类型香稻基因序列相应位置结合。所以扩增产物为583和169bp片段时，则该材料 为该突变类型香稻；产物为5 9 1和449bp片段时，则材料为非香稻或非本突变类型香稻。

图1 基因badh2第7外显子缺失位置区域序列及分子标记YY5－YY8Fig．1 Base sequences of deleted region in exon 7of gene badh2and molecular marker YY5－YY8

以已知属于该突变类型的香稻材料‘太湖香粳’和‘紫香糯861’，非该突变类型香稻材料‘大华香粳’和‘南粳46’，以及非香材料‘秀水123’的基因组DNA 为模板，利用标记YY5－YY8进行PCR 扩增，电泳检测结果表明，‘太湖香粳’和‘紫香糯861’可扩增出大小分别为583和169bp的2个片段，‘大华香粳’、‘南粳46’和‘秀水123’扩增出大小分别为591和449bp 的2 个片段（图2），证明标记YY5－YY8可用于筛选出基因Badh2第7外显子8bp缺失和3bp突变导致香味的水稻材料，而不能区分其他突变类型香稻材料和非香稻材料。

2．2 香稻材料基因型的分子标记检测

2．2．1 标记YY5－YY8的检测结果 分别以80份香稻材料的基因组DNA 为模板，利用标记YY5－YY8进行PCR 扩增。电泳结果（部分结果如图3，A）表明，共有‘广陵香糯’、‘广陵香粳’及‘江西香稻’等26份材料可扩增出大小分别为583和169bp的2个片段，说明这些香稻材料在Badh2基因第7外显子处存在8bp缺失和3bp突变，属于同一种香味基因变异类型。其余材料均扩增出大小分别为591和449bp的2个片段，说明这些香稻材料不属于第7外显子变异类型。

2．2．2 标记InDel－E2检测结果 分别以80份香稻材料的基因组DNA 为模板，利用标记InDel－E2进行PCR 扩增。电泳结果（部分结果如图3，B）表明，共有‘大华香粳’、‘丰优香’及‘关西香’等37份香稻材料可扩增出大小为100bp的片段，说明这些香稻材料在Badh2基因第2外显子处存在7bp缺失，属于同一种香味基因变异类型。其余材料均扩增出一条大小为107bp的片段，说明这些香稻材料不属于第2外显子变异类型。

2．2．3 标记FMbadh2－E4－5检测结果 分别以80份香稻材料的基因组DNA 为模板，利用标记FMbadh2－E 4－5进行PCR扩增。电泳结果（部分结果如图3，C）表明，所有材料均扩增出一条大小为1 123bp的片段，表明这些香稻材料在Badh2基因第4、5外显子处不存在缺失，均不属于这种香味基因变异类型。

图2 YY5－YY8对5份材料电泳检测图Fig．2 5materials were genotyped with YY5－YY8marker

3个标记检测统计结果见表3。由表3可以看出，80份香稻材料被分为2种香味基因突变类型，其中26份材料为第7外显子突变类型，37 份材料为第2外显子突变类型，无第4、5外显子突变类型材料。

另外，本实验材料中还有17份香稻均不属于这3种突变类型，有可能是已发现的其他突变类型，因此需要进一步搜集或开发可以鉴别出这些材料的功能分子标记；也有可能是尚未发现的新香味基因，可以根据这些材料开展新基因的鉴定、定位及克隆。

3 讨 论

图3 3个标记对部分香稻材料电泳检测图Fig．3 Some rice fragrant materials were genotyped with three molecular markers

表3 80份香稻材料分子标记检测结果分类Table 3 The detection results of 80fragrant rice materials with molecular markers

香味是稻米重要的食味品质性状，香稻资源遍布全球。到目前为止，认为水稻香味主要与第8染色体上编码甜菜碱醛脱氢酶基因Badh2 相关［12］，香味基因Badh2的致香环节是由其第2外显子、第4、5外显子及第7 外显子相关区域碱基缺失引起的。已有研究表明，大多数的香稻材料都是由于在Badh2基因第2外显子和第7外显子处发生碱基缺失而产生香味［13－14］，在第4、5外显子处发生碱基缺失的香稻材料报道极少，同时也有一些香稻材料在这3个区域都没有发生碱基变异。本研究通过3个香味特异分子标记在分子水平上对80份香稻资源进行了检测分类，共有63份香稻属于Badh2基因第2外显子和第7外显子处发生碱基变异，没有发现第4、5外显子处发生碱基缺失的材料，另外也有17份香稻不属于这3种基因变异类型。

充分挖掘利用香稻资源，结合分子标记开展香味基因辅助选择是当前进行优质香稻品种选育的主要策略，而分子标记检测的简易程度和成本高低是影响分子育种效率的重要因素［15－16］。已有香稻鉴定及利用研究［17－18］主要围绕Badh2基因第2 外显子和第7外显子碱基变异展开，且大多为设计的Indel类型标记，多态性片断仅有7或8bp碱基差异，必须借助聚丙烯酰胺凝胶电泳观察结果，操作程序繁琐不便于大量开展标记检测工作。本研究针对前人研究的不足，除根据Badh2基因的3处碱基变异均设计了相关分子标记进行香稻资源检测外，更主要围绕第7外显子处碱基变异特点利用扩增受阻突变体系PCR 技术开发了4 引物标记，PCR 产物多态性差异显著，借助琼脂糖凝胶电泳即可观察，电泳时间短，便于进行大量香味材料检测，更有利于提高香稻分子育种效率。

水稻香味的产生除了香味基因起主导作用外，还与产地气候、土壤及水等因素密切相关［19－20］。水稻香气的类型及浓淡主要是由香味遗传基因或背景控制还是受生长环境因子决定，目前研究还没有阐明。本研究旨在先通过分子标记对香稻资源进行香味基因分类，今后将利用气相色谱－质谱技术［21］对属于同一香味基因类型的香稻资源进行香味定量测定，结合对香味基因类型和生长环境因素的控制进一步开展香味产生的内外在机理研究。

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