同步抑制FAD2与FatB基因提高烟草种子油酸组分含量的研究

赵彦朋，刘 峰，李艳军，朱华国，张新宇，孙 杰

（1 石河子大学 农学院，新疆石河子832000；2 中国农业大学 农学与生物技术学院，北京100193）

植物油是食用油的重要来源，其脂肪酸组分的营养功能一直受到人们的重视。饱和脂肪酸会增加人体心血管疾病的发病几率［1－2］；多不饱和脂肪酸易氧化不稳定，在一般贮藏条件下易酸败产生异味，在加热过程中易形成自由基加速细胞老化，还易通过氢化作用生成反式脂肪酸，增加人体心血管疾病发病率［3－4］。单不饱和脂肪酸的油酸稳定性高，能降低有害胆固醇（LDL），维持有益胆固醇（HDL）的水平；此外，富含油酸的食用油可长时间保存和高温烹调而不易氧化变质［5－7］。因此，高油酸含量的植物油不仅有益于人们的身体健康，也可有效延长产品的保质期和货架期。提高油酸的相对含量，已成为目前油料作物品质改良的重要内容［8－12］。

在植物种子脂肪酸合成代谢过程中，油酸在Δ12－油酸去饱和酶（FAD2）的作用下生成亚油酸；同时棕榈酸等饱和脂肪酸又可在脂肪酸转运体的酰基转移酶B（FatB）的作用下转运到胞质中。酰基转移酶（FatB）和Δ12－油酸去饱和酶（FAD2）的活性高低对作物种子油中饱和与不饱和脂肪酸的含量起着重要作用［13－14］。在种子发育过程中，这些酶的编码基因分别是种子中高效表达的FAD2 与FatB基因。目前FAD2与FatB基因已在大豆（G．max）、棉花（G．hirsutum）、玉米（Z．mays）、花生（A．hypogaea）、油葵（H．annuus）、油菜（B．napus）和橄榄（O．europaea）等多种植物中分离得到［15－19］。由于RNA 干扰（RNAi）技术的高效、特异性等，应用RNAi技术对作物种子的FAD2基因进行调控，已先后获得多不饱和脂肪酸含量低，油酸含量高的转基因大豆、花生、油菜等［20－22］。另外，抑制FatB基因的表达水平，也获得低饱和脂肪酸含量的转基因芥花油［23］。如果同时降低种子油中多不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的含量，从而提高油酸组分的含量，具有重要的实用价值。然而，通过同时抑制多基因的表达来改良种子油品质的研究目前还少有报道。

烟草（NicotianatabacumL．）是遗传转化的模式植物，其转化再生体系较为成熟。为了研究同步抑制脂肪酸合成关键酶基因FAD2与FatB的表达对种子脂肪酸组分的影响，本实验以烟草为转化材料，利用前期构建的能同步抑制种子中FAD2 与FatB表达的RNAi载体［24］，在农杆菌介导下进行烟草遗传转化，对转化植株进行分子检测，同时测定分析烟草种子中各脂肪酸组分的含量，为进一步改良油料作物品质奠定基础。

1 材料和方法

1．1 植物材料

烟草品系NC89的无菌试管苗（新疆兵团绿洲生态农业重点实验室提供），以MS为基本培养基，附加3%葡萄糖，0．8%琼脂，pH 5．8，于28℃光下培养。

1．2 农杆菌菌株、质粒和主要试剂

试验用根癌农杆菌菌株（AgrobacteriumtumefaciensLBA4404），其含有棉籽脂肪酸合成关键酶FAD2与FatB双基因融合片段的干扰载体pBISPFAD2－FatB（图1）［24］，为新疆兵团绿洲生态农业重点实验室保存。

TaqDNA 聚合酶、植物组织总RNA 提取试剂盒和反转录试剂盒PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit等均购于大连宝生物（Takara）工程有限公司。PCR 的引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。DNA 分子量标准Marker购自东盛生物（DSBIO）科技有限公司；抗生素利福平（Rif）、卡那霉素（Kana）、链霉素（Str）和头孢霉素（Cef）为Sigma公司产品，其它试剂为进口或国产分析纯和色谱纯。

1．3 烟草的遗传转化

取－80℃冰箱内保存的含有pBISP－FAD2－FatB质粒的农杆菌LBA4404菌液，在加入抗生素（50mg／L Kana，50mg／L Rif，50mg／L Str）的LB固体培养基上划线，于28℃倒置暗培养2d，待平板上长出菌落后，挑取单菌落于20 mL LB 液体培养基中，于28℃、220r／min震荡培养2d，离心，用40 mL MS 液体培养基中悬浮，加入终浓度为100 μmol／L乙酰丁香酮（AS），继续培养2～3h，用于浸染。

图1 植物表达载体pBISP－FAD 2－FatB 结构示意图Fig．1 Structure of plant expression vector pBISP－FAD 2－FatB

烟草转化采用叶盘法［25］。将无菌烟草苗植株的叶片剔除叶脉和叶缘部分后剪成小方块，大小为1．0cm×1．0cm 的小块，浸入制备好的农杆菌菌液中，浸染10min。取出叶盘后，用菌滤纸吸干菌液，将叶盘背光面朝下平放在垫有滤纸的MS共培养基上，置于20℃暗培养［26］。2d后转移至选择培养基（MS＋2mg／L 6－BA＋0．2mg／L IAA＋100mg／L Kana＋400 mg／L Cef），于25℃、14h 光照培养。约4周后，切下幼芽插入生根培养基（MS＋6mg／L 6－BA＋50mg／L Kana＋200mg／L Cef），于25℃、14h光照条件下诱导生根，获得抗性烟草植株。洗净根部培养基，清水炼苗后转移至培养土中种植。

1．4 转基因烟草的PCR 检测

使用大连宝生物（Takara）工程有限公司的植物基因组DNA 提取试剂盒，提取对照与转化抗性烟草植株的基因组DNA；以特异性引物RNAi2－F（5′－AAATCCCAAATACCAGAG－3′）和RNAi2－R（5′－GAACAATCTTCCCTATGC－3′），PCR扩增FAD2－1与FatB双基因融合片段的部分序列（701bp）；检测转基因植株。PCR 扩增体系为10×ExTaqPCR缓冲液2．5μL，dNTP混合物（2．5mmol／L）2μL，RNAi2－F（10μmol／L）与RNAi2－R（10μmol／L）各1μL，烟草基因组DNA 2μL，ExTaq（5U／μL），加双蒸水至25μL。扩增条件为94℃预变性5min；然后94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1 min，共35个循环，72℃延伸10min。PCR 产物经过1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外凝胶成像系统中观测目的条带。

1．5 烟草FAD 2与FatB 的表达水平分析

将PCR 验证的阳性植株种植培养，收获T0代烟草种子，用含有100mg／L Kana的MS培养基筛选获得T1代转化植株。将T1代转基因植株种植到培养土中，在种子发育中后期，收获T1代种子，采用植物组织总RNA 提取试剂盒（Takara），提取烟草种子总RNA。使用GeneQuantTM1300 分光光度计（Biochrom Ltd）对提取的总RNA 进行定量；利用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit（Takara）将1μg总RNA 反转录成cDNA。以反转录cDNA为模板，qRT－PCR 分别检测烟草种子FAD2与FatB基因的mRNA 表达水平。以烟草Ubiquitin基因做内参，内参引物为Ubi－F（5′－CCGTCTCCGTGGTGGTATG－3′）和Ubi－R（5′－GGCCGTCTTCAAGTTGCTT－3′）；烟草FAD2与FatB的检测引物分别为FAD－F（5′－GGAGTTCTTGGAGCAGGTT－3′）和FAD－R（5′－CGTTCACGATTAGGAGGG－3′）；FatB－F（5′－GGGGCTCAATGCTAAGAAG－3′）和FatB－R（5′－CCATCCATAACGCCTACCT－3′）。反应体系共10 μL，包含SYBRPremixExTaqTMⅡ（2×）5μL，上下游引物（10μmol／L）各0．5μL，模板1μL，无菌水3 μL。每个样品设置3次重复。反应条件95℃预变性5min，95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸15s，45个循环。

1．6 种子总油脂提取和脂肪酸组分测定

用液氮将种子研磨成粉，取20mg装入10mL离心管中，在冰浴中用超声波细胞破裂仪破裂细胞30min；在离心管中加入6 mL 氯仿－甲醇（体积比2∶1）混合溶剂，在40℃、200r／min摇床上处理4 h后，6 000r／min离心10min，然后吸取下层油脂相层于恒重的医用玻璃瓶中，在32℃水浴旋转蒸发仪上蒸干。25℃真空干燥箱中干燥2h（至恒重），称重，计算油脂含量。将提取的总油脂置于10mL具塞试管中，加入2mL 1mol／L KOH－甲醇溶液，60℃水浴皂化30min，加入4mL 1mol／L盐酸－甲醇溶液，60℃水浴甲酯化30min，取出至室温。加入2mL 正己烷，充分振摇，静置，吸取上层正己烷甲酯相至2mL小离心管，用少量无水Na2SO4脱水后，用气相色谱（GC－MS）测定样品中主要脂肪酸组分的相对含量。GC－MS 分析条件为：色谱柱HP－5MS 19091S－436（60m×250μm×0．25μm）；进样量1μL，分流进样方式，分流比50∶1；进样口温度250℃；载气Ne，50mL／min。程序升温：150℃下保持1min；然后以10℃／min的速率升至180℃，保持5min；以3℃／min 的速率升至230℃，保持15min；再以3℃／min的速率升至270℃，保持20 min。

2 结果与分析

2．1 烟草的遗传转化与植株的PCR检测

采用农杆菌介导的烟草遗传转化，在选择培养1周左右，叶片周围开始膨胀，2周左右开始出现胚芽，4周左右开始长出幼芽。将幼芽转移到生根培养基上进行诱导生根培养，2周左右出现较丰富的根系。清水洗净根部培养基，在水中炼苗2d，然后移栽至培养土中种植培养（图2）。

经过Kana抗性筛选，共获得9 株抗性烟草植株，提取烟草植株基因组DNA，以特异性引物进行PCR 扩增，检测获得5株阳性转基因植株（图4）。

图2 农杆菌介导的烟草遗传转化Fig．2 Genetic transformation of tobacco mediated by Agrobacterium tumefaciens

图3 T0 代烟草种子的Kana筛选结果Fig．3 Screening results of T0seed

图4 烟草植株叶片PCR 检测双基因靶标片段Fig．4 Detection of target gene in control and transgenic tobacco leaves by PCR

图5 T1 代烟草基因组DNA 的PCR 验证结果Fig．5 PCR validation of T1transgenic tobacco genomic DNA

2．2 转基因烟草种子qRT－PCR分析

收获PCR 检测阳性的转基因烟草T0代种子，用20%次氯酸钠消毒10min，在100mg／L Kana选择培养基上筛选得到抗性幼苗（图3）。将抗性苗移至培养土中种植，正常生长18株，提取所有T1代烟草植株的基因组DNA 进行PCR 验证，结果显示均为阳性转基因植株（图5）。

转基因烟草T1代植株及对照在开花后25d左右，即烟草种子形成中后期，按照试剂盒说明书随机提取2株烟草种子总RNA（图6），反转录为cDNA，并进行qRT－PCR 分析。结果显示，转基因植株种子中2个基因表达水平均受到一定程度抑制。与对照相比，转基因烟草种子中FAD2和FatB的表达水平分别降低了23%和11%（图7）。

2．3 烟草种子脂肪酸组分及含量检测

图6 T1 代烟草种子总RNAFig．6 RNA extraction of T1generation seeds

图7 烟草种子中FAD 2与FatB 的qRT－PCRFig．7 qRT－PCR analysis of FAD 2and FatB in tobacco seeds

图8 烟草种子脂肪酸甲酯的气相色谱图Fig．8 GC／MS analysis of fatty acid methyl ester of tobacco seeds

图9 转基因与野生烟草种子油酸含量对比Fig．9 The content of oleic acids of transgenic compared with the wild tobacco seeds

分别提取对照和进行qRT－PCR检测的2株转基因烟草种子的脂肪酸，进行甲酯化处理并用气相色谱测定烟草种子脂肪酸组分和含量，重复3 次。结果显示（图8），烟草种子中主要含有4种脂肪酸，分别为棕榈酸（C16∶0）、硬脂酸（C18∶0）、油酸（C18∶1）和亚油酸（C18∶2）。

气相色谱测定表明，在转基因植株种子的脂肪酸组分中，饱和脂肪酸棕榈酸（C16∶0）和硬脂酸（C18∶0）含量分别为8．02%和4．45%，多不饱和脂肪酸亚油酸（C18∶2）含量为76．82%，而对照种子的C16∶0、C18∶0和C18∶2的平均含量分别为8．26%、4．94%和79．58%，与对照相比都存在不同程度的降低。转基因植株中油酸（C18∶1）组分的含量最高达7．48%，而对照种子种油酸含量为5．11%，比对照提高46．38%（图9）。

3 讨 论

随着社会的发展，人们的生活水平有了很大提高，也越来越提高了对健康的需求。棉籽油是中国第四大植物食用油。棉籽油中饱和脂肪酸与多不饱和脂肪酸含量偏高，因此改良棉籽油的营养品质，具有重要的实用价值。在植物种子脂肪酸合成代谢过程中，Δ12－油酸去饱和酶基因（FAD2）是控制油酸向亚油酸转化的关键酶基因，直接决定了植物中多不饱和脂肪酸的含量与比例。另外，植物脂肪酸合成途径中，饱和脂肪酸又可在脂肪酸转运体酰基转移酶B（FatB）的作用下转运到胞质中。抑制FatB基因的表达，在一定程度上可以降低饱和脂肪酸的含量，从而也有利于油酸的合成。然而，同时降低油料作物种子中多不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的含量，进而提高油酸的含量的研究目前仍然报道较少。

多元载体构建及其遗传转化技术是保证多个基因代谢途径协调表达有效技术方案［27－28］。在先前的研究中，成功地构建了针对棉花2 个靶标基因FAD2与FatB的RNAi载体［24］，为了研究同步抑制FAD2与FatB基因对棉籽油中脂肪酸各组分的影响，本研究首先对模式植物烟草进行了遗传转化，并对转基因烟草种子的脂肪酸组分进行了分析。结果表明，转基因烟草种子中饱和脂肪酸以及多不饱和脂肪酸含量都有所降低，油酸含量有极显著的提高（提高了46．38%）。说明同步抑制FAD2 和FatB基因表达对烟草种子的脂肪酸组分的含量有较大影响，这也为进一步研究同步抑制FAD2 和FatB基因的表达改良棉籽油的品质提供了理论和实践基础。

本研究结果也显示，在同步抑制了脂肪酸合成关键酶基因表达后，烟草种子的脂肪酸各组分含量出现不同程度的变化，但是与油菜等作物上的研究报道相比［23－25］，油酸含量并没有出现倍数性的提高。而且多不饱和脂肪酸C18∶2的含量还处于较高水平。推测可能是由于棉花的FAD2与FatB基因与烟草的FAD2与FatB基因的同源性所引起的。在本研究中，2个靶标基因片段均来自棉花，与烟草的一致性低于50%，较低的同源性降低了RNAi的效果。然而，本研究从另一方面也表明了RNAi技术改良作物油份品质的可行性，说明通过调控植物中脂肪酸的代谢途径来同时降低饱和脂肪酸与多不饱和脂肪酸，进而提高油酸在种子中的含量具有很大的发展前景。本研究验证了同步抑制双基因表达对烟草种子脂肪酸油分含量的影响，但对同步抑制FAD2与FatB基因表达改良棉籽油等油料作物品质还需要进一步研究。

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