下呼吸道烟曲霉菌分离株耐药性及基因型观察

罗劲，陈一强，孔晋亮，黄宏，邬丽红，王可，李冰，董必英

(广西医科大学第一附属医院呼吸疾病研究所，南宁530021)

下呼吸道烟曲霉菌分离株耐药性及基因型观察

罗劲，陈一强，孔晋亮，黄宏，邬丽红，王可，李冰，董必英

(广西医科大学第一附属医院呼吸疾病研究所，南宁530021)

目的 探讨下呼吸道烟曲霉菌烟曲霉菌耐药性和基因同源性。方法 从31例下呼吸道烟曲霉菌感染患者的痰液或肺泡灌洗液中分离烟曲霉菌，采用CLSI M38-A2微量液基稀释法测定其对伏立康唑、伊曲康唑、两性霉素B、卡泊芬净、米卡芬净的敏感性；采用随机扩增DNA多态性(RAPD)基因分型技术获得受试菌株的RAPD指纹图并进行同源性聚类分析。结果 31株受试烟曲霉对伏立康唑、伊曲康唑、两性霉素B、卡泊芬净、米卡芬净的耐药率分别为3.2%、12.9%、25.8%、0、0；31株烟曲霉共分为10种基因型(A～J)，其中B型10株，为主要流行型别；其余分别为A型5株，E型3株，F型4株，C、H、I型各2株，D、G、J型各1株。 结论 下呼吸道烟曲霉菌感染患者烟曲霉菌基因型以B型为主，伏立康唑、卡泊芬净、米卡芬净对烟曲霉菌的抑菌效果较好。

烟曲霉菌；耐药性；基因分型

烟曲霉菌是广泛存在于环境中的条件致病菌，主要以分生孢子的形式通过空气、接触等方式传播，容易造成医院内免疫低下患者深部真菌感染，其中下呼吸道感染最为常见，严重者甚至发生侵袭性肺曲霉病(IPA)。目前导致免疫缺陷住院患者获得性深部真菌感染的病原体中，烟曲霉菌仅次于白色念珠菌，排在第二位[1]。2011年9月～ 2013年8月，我们收治31例下呼吸道烟曲霉菌感染患者。现分析烟曲霉菌分离株的耐药性和基因型，以进一步明确下呼吸道烟曲霉菌感染的临床特点，提高其防治水平。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 31株烟曲霉菌取自31例下呼吸道烟曲霉菌继发感染患者，其中从深部晨痰分离出24株，肺泡灌洗液中分离出7株，经乳酸酚棉兰染色镜下形态学及48℃温度实验鉴定为经典烟曲霉菌。患者男18例、女13例，年龄47～78(61.8±11.2)岁，>50岁者27例。原发病为慢性阻塞性肺疾病15例，间质性肺疾病5例，肺炎4例，肺癌2例，支气管扩张2例，肺脓肿1例，肺结核1例，哮喘1例。住院时间>3周者29例，静脉使用应用广谱抗生素>2周者25例，长期静脉或口服糖皮质激素[相当于泼尼松0.5 mg/(kg·d)剂量]者18例，接受侵入性操作(包括气管插管或切开、中心静脉置管、深部吸痰等)16例，长期机械通气11例，合并糖尿病7例，低蛋白血症(血清白蛋白<35 g/L)5例，合并弥漫性结缔组织病2例。

1.1.2 主要试剂 药物敏感性试验质控菌株为近平滑念珠菌ATCC22019，由广西医科大学第一附属医院临床微生物检验中心提供。Star Spin Fungal DNA Kit真菌基因组提取试剂盒(北京康润生物科技有限公司)；玻璃珠(Sigma公司)；Premix TaqTMVersion2.0(日本Takara Biotechnology公司)；RPMI-1640粉末(Gibco公司)；MOPS(Sigma公司)；二甲基亚砜(DMSO，北京Solarbio公司)；马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA，中国路桥技术责任有限公司)；随机引物R108(GTATTGCCCT，北京华大基因科技股份有限公司合成)。

1.1.3 抗真菌药物 伏立康唑、两性霉素B、伊曲康唑溶解于DMSO，卡泊芬净溶解于灭菌水。均配制成32 mg/mL储存液，经0.22 μm滤器滤过并分装后，于-80 ℃保存。

1.1.4 仪器设备 梯度PCR仪(Bio-rad，T100),全自动凝胶成像系统(Bio-rad，Gel Doc XR+),普通型电泳电源(Bio-rad，Powerpac Universal),超微量核酸浓度测定仪(美国Thermo Nanodrop ND-2000)，无菌96孔板(Corning公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 烟曲霉菌药物敏感试验 将31株烟曲霉菌受试菌株复苏并转种于PDA斜面，37 ℃孵育72 h，用含0.025%Tween20的PBS液冲洗斜面表面收集孢子，经MOPS缓冲后pH为7.0的RPMI-1640重悬孢子，血细胞计数板调节使其终浓度为1×105CFU/mL。采用美国临床实验室标准协会(CLSI)M38-A2丝状真菌药敏指南中的方法测定31株烟曲霉菌对伏立康唑、伊曲康唑、两性霉素B、卡泊芬净、米卡芬净的药物敏感性。伏立康唑、伊曲康唑、两性霉素B最终浓度范围为0.03～16 μg/mL，卡泊芬净、米卡芬净为0.015～8 μg/mL。伏立康唑、伊曲康唑、两性霉素B的最低抑菌浓度(MIC)定义为肉眼直接观察到的无真菌生长的最低药物浓度；卡泊芬净、米卡芬净则读取其最低有效浓度(MEC)，即相对生长对照孔而言出现短、圆而异常分支菌丝时的最低药物浓度。因CLSI M38-A2方案尚未制定烟曲霉药物敏感性的判读折点，参照文献[2]，以MIC/MEC≤1 μg/mL为敏感，=2 μg/mL为中介，≥4 μg/mL为耐药。耐药率=(耐药菌株数+中介菌株数)/总菌株数×100%。

1.2.2 烟曲霉菌基因型分析 采用玻璃珠破壁法和真菌DNA提取试剂盒提取各菌株基因组DNA。从PDA斜面挑取活化后的烟曲霉菌落接种于SDB，置于摇床上于37 ℃、180 r/min培养48 h。4 000 r/min离心去后掉上清，往沉淀中加入1 mL真菌裂解液及6～8粒玻璃珠，漩涡混合仪持续震荡20 min后将裂解液转移至2 mL的EP管中，余下操作步骤按照试剂盒说明书进行。提取的烟曲霉基因组DNA用核酸浓度仪检测浓度及纯度。采用随机扩增DNA多态性(RAPD)基因分型技术获得受试菌株的RAPD指纹图并进行同源性聚类分析。经条件优化后的PCR反应体系总体积为50 μL，其中Premix Taq 25 μL，烟曲霉基因组DNA模板2 μL，引物R108(10 pmol/ mL)4 μL，灭菌蒸馏水19 μL。RAPD-PCR反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共45个循环，最后72 ℃充分延伸10 min，4 ℃保存。取PCR产物10 μL，于含0.5 g/μL溴乙啶的1.5%琼脂糖中电泳(5 cm/V)，凝胶成像仪上观察分析条带。将凝胶成像仪上获取的DNA指纹图导入Crosschecker 2.91软件分析识别电泳条带，并核对及手工校正软件自动识别错误的条带，导出一个含有0和1数据矩阵的.NTS文件。将.NTS文件导入NTSYS pc 2.10软件计算相似系数，并用UPGMA法进行同源性聚类分析。

2 结果

2.1 药物敏感性 受试的31株烟曲霉对两性霉素B耐药率为25.8%，对伏立康唑、伊曲康唑的耐药率分别为3.2%、12.9%，无对卡泊芬净、米卡芬净耐药菌株，详见表1。

2.2 烟曲霉菌基因型及同源性 31株下呼吸道分离烟曲霉菌株经随机引物R108扩增，均可产生指纹图谱(分型率100%)，扩增DNA的片段数为1～7，最小片段约为200 bp，最大片段为2 000 bp，所有菌株在1 000 bp处均可产生特征性条带(见图1)。经NTSYS pc 2.10聚类分析，根据图谱情况及专业知识，以相似系数>0.8作为判定同型菌株的标准，31株菌分为A～J共10种基因型，其中B型10株，为主要流行型别；A型5株，E型3株，F型4株，C、H、I型各2株，D、G、J型各1株(见图2)。

图1 31株受试烟曲霉菌的RAPD指纹图谱

图2 31株受试烟曲霉菌的聚类分析树状图

3 讨论

三唑类药物伏立康唑、伊曲康唑，多烯类药物两性霉素B及其脂质体以及棘白菌素类药物卡泊芬净及米卡芬净等均为烟曲霉菌感染的主要治疗药物。近年来有报道已经出现烟曲霉菌交叉耐药及多重耐药菌株[6]。研究发现，烟曲霉菌若在感染者体内形成生物被膜，则菌体在胞外基质的包被下，对抗真菌药物的敏感性明显降低[4]，常规剂量常不能达到治疗效果。本研究31株受试烟曲霉菌对两性霉素B的耐药率为25.8%，与全球抗生素监测项目报道的28.6%[7]接近，主要是因为耐药菌株可在周围环境广泛存在并通过空气、接触、候鸟迁徙等途径向世界各地传播[8]。两性霉素B及其脂质体为传统治疗IPA等下呼吸道烟曲霉菌感染的首选药物，但不良反应较多且耐药率较高。目前多以不良反应相对较少、敏感性较好的三唑类药物，例如伏立康唑作为首选[9]。国内外文献报道烟曲霉菌对三唑类药物耐药率为0～6.0%[10]，本研究受试烟曲霉菌对伏立康唑、伊曲康唑耐药率分别为3.2%、16.1%，且三唑类耐药菌株MIC值处于中介或较低耐药水平，不存在交叉耐药菌株。伊曲康唑的耐药率偏高，可能是由于本地区部分基层医院以伊曲康唑进行预防性或经验性治疗有关，因此有必要对伊曲康唑药物敏感性进行动态监测。同时应规范基层医院抗真菌药物的使用，及时进行体外药敏试验以指导临床用药。本研究中31株受试菌株对卡泊芬净及米卡芬净的敏感率达100%，符合目前文献报道棘白菌素类耐药的烟曲霉菌株仅为极少数FKS1基因突变的实验菌株，尚未发现临床分离的耐药菌株[11]的结论，这可能与该类药物为近年刚上市的新药，价格相对昂贵，仅用于治疗危重或挽救不能耐受其他药物的IPA患者有关。棘白菌素类抗真菌药物毒性低，且不与其他抗真菌药物产生拮抗，因此在联合用药治疗下呼吸道烟曲霉菌感染方面具有很广阔的应用前景。

发生下呼吸道烟曲霉菌感染的患者可作为感染源，病原体通过空气或接触传播等途径，造成病房内其他有感染危险因素尤其免疫力低下的患者感染烟曲霉菌，甚至造成烟曲霉菌院内感染暴发流行。用简易可靠的基因分型方法对烟曲霉菌株的同源性及其他分子流行病学特征进行分析，有助于控制并阻止病原体传播。RAPD技术是一种DNA指纹图谱多态性分析方法，不仅具有常规PCR技术快速、灵敏、简便、分型率高等特点，而且由于其引物具有通用性，不需预先知道靶基因的核苷酸序列，目前在分子流行病学研究中广泛应用。本研究31株烟曲霉菌共分为10种基因型，呈现出较为明显的多态性，与空气或某些物品的流通以及探视人员来往频繁，将外界环境中不同基因型的菌株带入医院病房内有关。应应严格病房管理，尽量减少探访，加强医护人员的消毒隔离观念。本研究基因型分型结果显示，为B型烟曲霉菌为主要流行型别。同一病区存在多于2株以上来自不同患者的同源菌株感染，高度提示存在该菌株引起的医院感染在局部爆发流行的可能，应及时采取干预措施，阻断其进一步发展。本研究基因型为B型的7、8、9号菌株分离自同一时期在同一病区住院的3例患者，提示可能发生该型菌株的交叉感染。16、24、29、30号菌株相对应的4例患者在较长一段住院时间内序贯发生同一RAPD型别的烟曲霉菌感染，其中16号菌株感染的患者最先发生肺部烟曲霉菌感染，其病程覆盖了其他几位患者的发病时间，因此该患者很可能是造成后续几例患者感染的源头。回顾病史资料发现，该患者临床诊断为支气管扩张合并肺曲霉球病，此类患者肺局部形成带被膜的肺曲霉球[12]，可作为潜在的慢性感染源。因此应尽量将该患者安排至层流隔离病房密切观察病情，妥善处理其呼吸道分泌物及医疗用物，同时积极治疗其肺部的烟曲霉菌感染灶，对其进行医疗护理操作前后应做好手部清洁，防止菌株通过接触途径传播。

综上所述，临床上应对有下呼吸道烟曲霉菌感染危险因素的呼吸内科住院患者采取积极有效的预防措施，临床用药应以药物敏感性试验结果作为指导。RAPD基因分型技术在早期发现感染源，预防和监控院内烟曲霉感染方面具有较好的实用价值和可行性。

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·作者·编者·读者·

更正

我刊2013年第53卷46期刊登的《Toll样受体4与糖尿病肾病的关系研究进展》一文通信作者为陆卫平，第一作者单位是南京医科大学附属淮安第一医院。基金项目是国家自然科学基金青年项目(81200595)。

本刊编辑部

Antifungal susceptibility and genotyping analysis of aspergillus fumigatus caused lower respiratory tract infection

LUOJing，CHENYi-qiang，KONGJin-liang，HUANGHong，WangKe，LIBing,DONGBi-ying

(InstituteofRespiratoryDisease，FirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity，Nanning530021，China)

Objective To study the resistance and homology of aspergillus fumigatus that caused lower respiratory tract infection. Methods The 31 clinical strains of aspergillus fumigatus were respectively isolated from the sputum and bronchoalveolar lavage fluid of patients who suffered from lower respiratory tract aspergillus fumigatus infection . The susceptibility of five antifungal agents against aspergillus fumigatus was measured by liquid microdilution method and the homology of strains was analyzed with random amplified polymorphic DNA(RAPD)assay. Results The resistance of the 31 tested aspergillus fumigatus strains was 3.2% to voriconazole，12.9% to itraconazole，25.8% to amphotericin B whereas all sensitive to caspofungin and micafungin. By RAPD，the 31 strains were divided into 10 genotypes(A～J)，among which Type B was the major prevalent genotype that consisted of 10 strains. Conclusions The genotype B was proved to be the relevant type that caused lower respiratory tract aspergillus fumigatus infection in the surveyed hospital.Voriconazole，caspofungin，micafungin exhibited favorable antifungal activity against Aspergillus fumigatus isolates in vitro.

aspergillus fumigatus； drug resistance； genotyping

国家自然科学基金资助项目(81260002)。

罗劲(1989-)，男，在读硕士研究生，研究方向为肺部感染性疾病的基础研究。E-mail：66875350@qq.com

陈一强(1959-)，男，博士，教授，博士研究生导师，研究方向哮喘、肺栓塞及肺部感染性疾病的基础研究。E-mail：chenyq2013@sohu.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.06.005

R563.1

A

1002-266X(2015)06-0014-04

2014-11-18)