异位子宫内膜组织间质细胞培养液中VEGF、sflt-1表达及意义

武生梅，史淑红，李艳芳，李荣霞，李洁

(1赤城县人民医院，河北张家口075500；2河北医科大学第二医院；3河北中医学院)

异位子宫内膜组织间质细胞培养液中VEGF、sflt-1表达及意义

武生梅1，史淑红2，李艳芳2，李荣霞2，李洁3

(1赤城县人民医院，河北张家口075500；2河北医科大学第二医院；3河北中医学院)

目的 探讨VEGF及其受体在子宫内膜异位症(EMs)发生中的作用。方法 采用细胞原代培养技术培养48例子宫内膜异位症患者(异位症组)在位、异位子宫内膜细胞及30例无子宫内膜异位症患者(对照组)子宫内膜细胞，检测其细胞培养液中VEGF及其可溶性受体sflt-1表达；计算VEGF活性指数(VEGF/ sflt-1)。结果 异位症组在位、异位细胞培养液VEGF、sflt-1水平及VEGF活性指数均高于对照组(P均<0.05)，在位及异位细胞培养液中VEGF、sflt-1水平及VEGF活性指数相比差异无统计学意义。结论 EMs患者子宫内膜组织sflt-1表达相对不足；此可能为EMs发生的原因之一。

子宫内膜异位症；子宫内膜细胞原代培养；血管内皮生长因子；血管内皮生长因子可溶性受体

子宫内膜异位症(EMs)是妇科最常见的疾病之一，其为良性疾病，但有恶性肿瘤的侵袭、转移等行为，且发病机制复杂[1]。研究证实，EMs的发生发展离不开新生血管的形成，而VEGF为有强力的促血管生成因子。sflt-1(sVEGFR-1)为VEGF的受体之一，与VEGF有高度的亲和力，其不具有酪氨酸激酶活性，为天然的VEGF抑制剂[2]。为探讨其在EMs发生中的作用，我们于2013年5月～2014年2月进行了如下研究。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2011年6月～2012年6月在河北医科大学第二医院因EMs行腹腔镜手术治疗的48例患者，年龄20～48岁，术后病理证实为EMs，根据美国生育协会(R-AFs)分期标准，Ⅰ～Ⅱ期15例，Ⅲ～Ⅳ期33例。取得异位病灶48份，在位内膜32份，分别为异位组和在位组。选择同期因卵巢良性肿瘤、宫颈病变、浆膜下肌瘤、输卵管疾病等非内异症原因接受子宫切除的患者以及接受宫腔镜检查的非EMs患者30例，为对照组，年龄32～48岁(子宫内膜为增生期18例、分泌期12例)，术后病理证实为正常的子宫内膜。两组均月经规律(28～32 d)，未合并其他外科疾病，术前6个月未接受过激素类药物治疗，6个月内无妊娠及哺乳史。各组受试者年龄、BMI、孕次、产次、月经周期、经期天数差异均无统计学意义。

1.2 细胞原代培养 术中取得在位及异位子宫内膜组织标本后，迅速用无菌冰生理盐水冲洗3遍，置入含有冰DMEM液无菌瓶中，30 min内送至实验室。依照文献[3～5]方法行间质细胞分离培养：将内膜组织剪碎，组织大小1 mm3，无菌生理盐水冲洗2次，置入烧杯，加入胰蛋白酶液。于5%CO2、37 ℃、饱和湿度培养箱中消化。2～3 h后加入含15%的小牛血清培养液终止消化。将细胞悬液吹打均匀，加入缓冲液PBS 5 mL，550 r/min离心4 min，取上清，800 r/min离心4 min，去上清，PBS吹打清洗2～3次，800 r/min，离心4 min，去上清，加入细胞培养液，吹打为均匀的细胞悬液，置细胞培养瓶中，于5%CO2、37 ℃、饱和湿度培养箱中培养。24 h以后更换细胞培养液，倒置显微镜每天观察细胞生长情况，隔日更换细胞培养液1次。在位组、异位组各有26、20例细胞原代培养成功。

1.3 细胞培养液中VEGF与sflt-1水平检测 各组换液过程中收集细胞培养液及2次冲洗液，800 r/min离心4 min，取上清，记录总体积，分别取3 mL，采用ELISA法测定游离VEGF和sflt-1水平，最终反应板在Bio-Rad 2250酶标检测仪于450 nm处读取光密度值，所测值按照标准曲线换算成VEGF及sflt-1水平。依据各组细胞液的体积及血细胞数(血细胞计数器测得)计算每105个细胞表达VEGF及sflt-1水平。VEGF/ sflt-1为VEGF活性指数。

2 结果

异位组在位、异位内膜细胞培养液中VEGF、sflt-1水平及VEGF活性指数均高于对照组(P均<0.05)，在位、异位内膜细胞培养液VEGF、sflt-1水平及VEGF活性指数相比差异无统计学意义。见表1。

表1 各组细胞培养液中VEGF、sflt-1表达比较

注：与对照组相比，*P<0.01。

3 讨论

EMs是一种妇科常见病，可以导致不孕、性交痛，是多年来妇科领域中的研究热点。子宫内膜细胞原代体外培养是目前研究EMs的常用方法，细胞离开机体时间较短，可以更好的反映疾病的特点，且无伦理问题。子宫内膜细胞分为腺细胞和间质细胞，其中腺细胞的体外培养较困难，几乎不能完成传代，故传代后的子宫内膜细胞大多为子宫内膜间质细胞。

有报道，EMs患者的在位子宫内膜血管形成活性明显增强，存在血管异常增生现象[6]；EMs是一种血管依赖性疾病，VEGF在血管发生和形成中起着中枢性的调节作用，是最关键的血管形成刺激因子[7～9]。子宫内膜的血管形成受到促血管生成因子和抗血管生成因子共同调控，其平衡被打破会导致疾病的发生，例如月经过多和EMs[10]。本课题组前期研究证实VEGF及sflt-1在在位子宫内膜及异位子宫内膜中表达与对照组相比存在显著差异。本研究结果显示，EMs患者在位内膜及异位内膜细胞培养液中VEGF及sflt-1的表达及VEGF活性指数均较对照组升高。表明EMs患者在位及异位子宫内膜组织sflt-1表达相对不足，使血管生成调节平衡中抑制血管生成的作用降低，促血管生成作用相对占优势，促进了EMs疾病发生发展中的血管生成，为异位子宫内膜细胞黏附后的种植、病灶形成提供了条件。

sflt-1为VEGF的天然抗体之一，其抗血管生成作用已被临床证实，且在肿瘤[11]、子痫前期[12～16]、习惯性流产[17]等疾病诊治的相关研究中取得一定进展。EMs为一种血管依赖性疾病，抗血管形成为其治疗思路。本研究结果及我们的前期研究均证实，sflt-1在EMs患者血液、腹腔液、组织、细胞培养液中表达均相对不足，因此用sflt-1作为抗血管形成治疗靶点治疗EMs应该是有临床价值的。但确切效果尚需进一步研究证实。

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河北省科技计划项目(12277740)。

史淑红

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.06.014

R711.5

B

1002-266X(2015)06-0040-02

2014-11-16)