国产卡泊芬净对曲霉菌的体外活性评估

于淑颖 张丽 李颖 徐英春

(1.中国医学科学院北京协和医院检验科侵袭性真菌病机制研究与精准诊断北京市重点实验室，北京 100730；2.中国医学科学院北京协和医学院，北京 100730)

随着罹患自身免疫病、艾滋病、肿瘤等恶性疾病患者数量的不断增多，侵袭性曲霉病在临床的发病率也逐年升高[1]。根据2008年美国感染病协会(IDSA)公布的曲霉病治疗指南，对于侵袭性肺曲霉病，尤其是威胁生命的严重感染，首选唑类抗真菌药物。但是随着唑类抗真菌药物的推广应用，曲霉对其耐药的报道逐渐增多，且曲霉对氟康唑和酮康唑呈现天然耐药[2]。

卡泊芬净(caspofungin)是新型棘白菌素类抗真菌药物，通过非竞争性抑制1,3-β-D葡聚糖的合成、破坏真菌细胞壁的完整性来发挥抗真菌作用。2001年，卡泊芬净(默沙东公司，商品名科赛斯)获得了美国食品药物管理局(FDA)和欧洲药品管理局(EMA)的许可，全球范围内用于念珠菌病、不明原因的中性粒细胞减少性发热患者的经验性抗真菌治疗和(脂质体)两性霉素B和(或)伊曲康唑治疗无效或不能耐受的侵袭性曲霉病[3]。卡泊芬净对曲霉菌属(包括烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、构巢曲霉、土曲霉和白曲霉)具有很好的体外活性[4]。

本研究就中国江苏恒瑞医药股份有限公司生产仿制药卡泊芬净(商品名卡净，以下称国产卡泊芬净)对侵袭性曲霉菌的体外抗真菌药物敏感性，与进口卡泊芬净(默沙东公司，商品名科赛斯，以下称进口卡泊芬净)进行对比，评估国产和进口卡泊芬净体外抗真菌活性的一致性。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株来源 本研究选取北京协和医院2014-2016年呼吸道、血液、腹腔等部位分离的37株烟曲霉、15株黄曲霉、10株黑曲霉、5株土曲霉、4株构巢曲霉以及日本曲霉、塔宾曲霉、溜曲霉和聚多曲霉各1株，共计75株。

质控菌株 近平滑念珠菌ATCC 22019和克柔念珠菌ATCC 6528为标准菌株。

试剂与仪器 本研究所用药物，国产卡泊芬净(中国江苏恒瑞医药股份有限公司，商品名卡净，0.5 g/瓶)，进口卡泊芬净(美国默沙东公司，商品名科赛斯，0.5 g/瓶)，米卡芬净(中国安斯泰来制药有限公司，商品名米开民，0.5 g/瓶)，泊沙康唑(美国默沙东公司，商品名诺科飞，混悬液，5 mL：200 mg)；氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑和两性霉素B标准品从中国食品药品检定研究院购买。科马嘉显色培养基(法国科马嘉公司)；沙堡弱培养基(英国OXOID公司)；RPMI1640培养基，含谷氨酰胺不含碳酸氢盐并以酚红为指示剂，使用0.165 mol/L MOPS缓冲液调pH7.0±0.1(德国sigma-aldrich公司)；无菌U型96孔板(江苏省海门盛泰实验器材厂)；全自动加样仪器Sentititre AIM(赛默飞世尔科技公司)。

1.2 方法

VITEK MS 入组菌株采用VITEK MS进行鉴定，菌落均匀涂布在靶板上，滴加1μL基质，待干燥后放入机器采集峰图，与数据库中的峰图比对得出鉴定结果及鉴定率，具体操作遵照仪器使用说明书。可信度大于60%，认为鉴定至种水平。

基因测序 通过钙调蛋白基因扩增和测序进行进一步鉴定，所有菌株均鉴定至种的水平[1]。采用试剂盒纯化方法，根据说明书提取曲霉菌DNA，将DNA产物送至北京睿博兴科生物技术有限公司进行测序，测序结果在GenBank网站上进行比对。

药敏试验 严格按照美国临床实验室标准化协会(CLSI)M38推荐的微量液基稀释法[5]，平行测试卡泊芬净(0.008～8 μg/mL)、国产卡泊芬净(0.008～8 μg/mL)、米卡芬净(0.008～8 μg/mL)、泊沙康唑(0.015～16 μg/mL)、伊曲康唑(0.015～16 μg/mL)、伏立康唑(0.015～16μg/mL)和两性霉素B(0.015～16 μg/mL)。

数据分析 根据MEC/MIC值计算MEC/MIC范围、MEC50/MIC50、MEC50/MIC90和几何均数(GM)，结果判读以CLSI M59推荐折点为判断标准，米卡芬净的结果判读参照Li等研究者的推荐[6, 7]，比较两种卡泊芬净药敏检测结果间的一致性及8种抗菌药物的抗菌活性。两种卡泊芬净的一致性通过分类一致性(极大错误、大错误和小错误的发生率)以及基本一致性进行评价。分类一致性(categorical agreement， CA)指待测药物与参考药物判读结果的一致性，如二者均判读为敏感、中介或耐药[8]。实质一致性(essential agreement, EA)指被待测药物检测MIC值与参考药物相差不超过1个稀释倍数[9]。

2 结 果

2.1 菌种鉴定结果

以钙调蛋白基因测序结果为“金标准”，VITEK MS的结果显示无法鉴定出塔宾曲霉和溜曲霉，并将日本曲霉错误鉴定为黑曲霉，造成这种现象的原因是由于VITEK MS数据库中不包含上述3种菌种。除此之外，VITEK MS将其余72株曲霉菌均正确鉴定至种水平。

2.2 7种抗真菌药物对75株曲霉临床分离株的抗菌活性

表1显示7种抗真菌药物对75株曲霉临床分离株的抗真菌活性，总体来看，全部抗真菌药物对绝大多数菌株具有较低的MIC或MEC值，棘白菌素类药物的MEC值总体低于唑类药物的MIC值，而米卡芬净对全部曲霉菌株的MEC50和MEC90比卡泊芬净低出2个梯度。唑类药物中，伊曲康唑MIC50和MIC90(1 μg/mL和2 μg/mL)最高，高于伏立康唑(0.5 μg/mL和1 μg/mL)和泊沙康唑(0.12 μg/mL和0.5 μg/mL)。两性霉素B对98.7%的菌株(74/75株)的MIC值≤2 μg/mL，只有1株黄曲霉的MIC值为4 μg/mL。

除了伊曲康唑(敏感率59.5%)，37株烟曲霉对其他抗真菌药物的敏感率均高达100%。黄曲霉和黑曲霉中也观察到类似的结果，15株黄曲霉和10株黑曲霉对伊曲康唑的敏感率分别为93.3%和60%。相较于其他菌种，两性霉素B对黄曲霉的MIC值更高，MIC50和MIC90分别为2 μg/mL和4 μg/mL。综合来看，国产卡泊芬净和进口卡泊芬净具有相同的MEC范围、MEC50和MEC90。但是分菌种来看，国产卡泊芬净对烟曲霉的MEC50(0.03 μg/mL)低于进口卡泊芬净(0.06 μg/mL)；国产卡泊芬净对土曲霉的MEC90(≤0.008 μg/mL)低于进口卡泊芬净(0.015 μg/mL)；国产卡泊芬净对其他不常见曲霉的MEC50和MEC90(均为0.015 μg/mL)低于进口卡泊芬净(均为0.03 μg/mL)。

2.3 国产卡泊芬净和进口卡泊芬净药敏测定结果间的一致性分析(见表2)

两种卡泊芬净对曲霉抗菌药物敏感性结果的分类一致性和实质一致性均高达100%。国产卡泊芬净和进口卡泊芬净仅对11株曲霉菌的MEC值存在不一致，包括8株烟曲霉、1株黄曲霉、1株土曲霉和1株塔宾曲霉，且国产卡泊芬净对上述菌株的MEC值仅较进口卡泊芬净低一个浓度梯度。总体来说，两种卡泊芬净对曲霉菌体外药敏测定结果高度一致。

表1 7种抗真菌药物对75株曲霉临床分离株的抗菌活性

(续表)

表2 两种卡泊芬净对75株曲霉菌的MEC值的比较以及一致性评价

2.4 棘白菌素类药物24 h和48 h药敏测定结果的一致性分析(见表3)

卡泊芬净和米卡芬净对超过76%的曲霉菌24 h和48 h的药敏测定结果完全一致。48 h时，国产卡泊芬净和进口卡泊芬净分别对4株曲霉菌的MEC结果较24 h高出2个浓度梯度，分别对10株和14株曲霉菌高出1个浓度梯度。米卡芬净对曲霉菌24 h和48 h的药敏测定结果间具有最高的一致性，仅有7株曲霉菌相差1个浓度梯度。

表3棘白菌素类药物对75株曲霉菌24 h和48 h药敏测定结果的一致性分析 (n)

Tab.3Comparison of 24h and 48h MEC values of echinocandins against 75Aspergillusisolates

药物棘白菌素类药物对曲霉菌24 h和48 h MEC结果相差梯度株数比较0+1浓度梯度+2浓度梯度卡泊芬净(国产)61104卡泊芬净(进口)57144米卡芬净6870

3 讨 论

曲霉菌是环境中广泛存在的条件性致病真菌，可引起人类的过敏性、慢性或者侵袭性曲霉病。侵袭性曲霉病是曲霉菌感染最严重的一种类型，主要累及免疫功能缺陷的患者，在免疫缺陷患者中具有很高的发病率和死亡率[10]。从全球范围来看，烟曲霉是造成侵袭性曲霉病最常见的致病菌，超过90%的侵袭性曲霉病是由烟曲霉引起的，其次是黄曲霉、黑曲霉和土曲霉。唑类药物是曲霉病治疗最主要的一线药物，然而，曲霉的唑类药物耐药现象已经成为刻不容缓的全球问题[11]。卡泊芬净具有不同于唑类药物的独特作用机制，大量体外试验的证据表明卡泊芬净产生耐药性的可能性极低[12]。

本研究结果表明，棘白菌素类药物对曲霉菌临床分离株展现了很高的体外抗真菌活性，米卡芬净的体外抗真菌活性又高于卡泊芬净，这一结果与Pfaller等[13]研究者的报道一致。根据CLSI规定的流行病学折点(epidemiological cutoff values, ECVs)进行判读，本研究全部菌株对伏立康唑和泊沙康唑均敏感，但是分别有16株烟曲霉、2株黄曲霉和5株黑曲霉对伊曲康唑耐药。这一现象的原因可能可以用Prigitano等的研究进行解释：近年来，大量农业唑类抗真菌剂的广泛使用导致了环境耐药菌株的产生，其主要的耐药机制为Cyp51A基因上游启动子出现TR34/L98H突变，而这一突变主要与伊曲康唑的耐药高度相关，与伏立康唑和泊沙康唑的抗菌敏感性没有明确关系[11]。这一结果也提示我们加强对临床和环境曲霉菌的抗真菌耐药监测，寻找替代杀菌剂，对减少因使用农业唑类抗真菌剂而产生的耐药至关重要。

已有报道表明两性霉素B对土曲霉具有较高的MIC值[14]，本研究中两性霉素B对5株土曲霉的MIC50和MIC90的分别为0.5 μg/mL和1 μg/mL，未观察到较高的MIC值，可能是由于菌株数量有限。值得注意的是，本研究中两性霉素B对15株黄曲霉菌株的MIC50和MIC90分别为2 μg/mL和4 μg/mL，明显高于其他菌种，因此，临床工作中对曲霉菌进行药敏试验对于合理治疗至关重要。

不同于曲霉菌加入唑类药物和两性霉素B后， 35℃孵育48 h再读取其MIC值，CLSI推荐曲霉菌加入棘白菌素类药物后，35℃孵育24 h即可读取其MEC值，即与单纯曲霉生长对照孔的菌丝相比，显微镜下开始观察到菌丝变短、变粗和高度分叉改变的最低药物浓度[5]。本研究对卡泊芬净和米卡芬净24 h和48 h药敏测定结果的一致性进行了比较，发现卡泊芬净对超过76%的曲霉菌24 h和48 h的药敏测定结果完全一致，而米卡芬净的一致性更高(90.7%)。

此外，本研究显示受试菌体外对国产卡泊芬净与进口卡泊芬净的敏感性高度一致，国产卡泊芬净与进口卡泊芬净对37株曲霉菌的MEC值中，仅11株菌的MEC值存在不一致，且仅相差一个浓度梯度，无极大错误、大错误和小错误的发生。因此，两种卡泊芬净对曲霉体外药敏测定结果高度一致。而且国产卡泊芬净对烟曲霉、土曲霉和其他少见曲霉的体外抗真菌活性可能优于进口卡泊芬净。

综上所述，相较于唑类药物和两性霉素B，卡泊芬净对曲霉具有较好的体外抗真菌活性，且国产卡泊芬净与进口卡泊芬净的体外抗菌活性高度一致。