辛伐他汀对耐紫杉醇人肺腺癌细胞增殖和细胞周期的影响

苏克莉，郭亮，李静

(1山东大学医学院，济南250013；2济南市第四人民医院)

·临床研究·

辛伐他汀对耐紫杉醇人肺腺癌细胞增殖和细胞周期的影响

苏克莉1,2，郭亮2，李静2

(1山东大学医学院，济南250013；2济南市第四人民医院)

目的 探讨辛伐他汀联合紫杉醇对人肺腺癌耐紫杉醇细胞株增殖的影响。方法 用0、10、20、40、80 μmol/L的辛伐他汀处理耐紫杉醇A549细胞(A549/Taxol)24、36、48 h，用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测算各组细胞增殖率。用含有20 μmol/L的辛伐他汀(辛伐他汀组)、10-7mol/L紫杉醇(紫杉醇组)及20 μmol/L的辛伐他汀+10-7mol/L紫杉醇(联合组)培养A549/Taxol细胞，24、48 h后用MTT法测算各组细胞增殖率，24、36、48 h后用流式细胞术检测各组细胞周期。结果 辛伐他汀能浓度依赖性(10 ～40 μmol/L)地抑制耐紫杉醇A549/Taxol细胞增殖，而且抑制作用呈时间依赖性(P均<0.05)。相同时点比较联合组细胞增殖抑制率和G1期细胞比例高于辛伐他汀组、紫杉醇组和空白对照组。结论 辛伐他汀可抑制A549/Taxol增殖，辛伐他汀联合紫杉醇对A549/Taxol增殖有协同抑制作用。

辛伐他汀；紫杉醇；非小细胞肺癌；细胞增殖；细胞周期

非小细胞肺癌(NSCLC) 患者确诊时约2/3已属晚期或发生转移，失去手术机会，需要化学药物治疗，但复发率高，且对大多数化疗药物不敏感 ，预后很差[1]。紫杉醇是NSCLC临床治疗的一线药物，近年来其耐药率逐渐升高，严重影响了化疗效果[2]。研究发现，他汀类降血脂药辛伐他汀能显著抑制乳腺癌、前列腺癌、胶质瘤等多种肿瘤细胞增殖，具有较好的抗肿瘤能力[3]。服用他汀类药物6个月以上在不同年龄及种族中肺癌发生的风险可下降55%[4]。2013年6月～2013年10月，我们观察了辛伐他汀联合紫杉醇对耐紫杉醇A549细胞(A549/Taxol)增殖的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人肺腺癌耐紫杉醇A549细胞株(A549/Taxol)由山东省肿瘤医院中心实验室惠赠，A549/Taxol细胞可在10-7mol/L的紫杉醇中正常生长。辛伐他汀、紫杉醇购自中国药监所，溶解稀释后-20 ℃冻存，使用前用培养液稀释成所需的浓度。其他主要仪器和试剂有DMEM培养基、胰蛋白酶、胎牛血清(美国Gibco公司)，四甲基偶氮唑盐(MTT，美国Sigma)、二甲基亚砜(DMSO，美国Sigma)、流式细胞仪(德国PARTEC公司 )

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 A549/Taxol细胞株用含10%胎牛血清及0.1%青霉素/链霉素的DMEM培养基，于37 ℃、5%CO2培养箱中常规培养、传代。

1.2.2 辛伐他汀对A549/Taxol细胞增殖的影响的观察 将A549/Taxol细胞制成细胞悬液，以每孔4×103个细胞接种于96孔平底培养板中，37 ℃、5%CO2孵箱内培养，每孔培养液为100 μL。细胞培养过夜贴壁后，用0、10、 20、 40、 80 μmol/L辛伐他汀分别处理细胞24、36、48 h，倒置相差显微镜下观察细胞形态变化。培养结束前每孔加入以磷酸盐缓冲液(PBS)稀释的5 mg/mL噻唑蓝溶液15 μL，继续孵育4 h后，终止培养，吸弃孔内上清液，每孔加入150 μL二甲基亚砜，静置10 min待结晶物充分溶解，用酶标仪在波长492 nm处测量各孔的吸光值(A)。同时设置阴性对照组(仅加DMSO，不加药物处理) 和空白对照组(无细胞，仅加无血清DMEM) ，各组均设5个复孔。计算细胞抑制率和辛伐他汀的IC50值。取IC50附近的浓度(20 μmol/L)进行下面的实验。

1.2.3 辛伐他汀联合紫杉醇对A549/Taxol细胞增殖的影响的观察 将A549/Taxol细胞制成单细胞悬液，以每孔4×103细胞接种于96孔平底培养板中，37 ℃、5%CO2孵箱内培养，每孔培养液体积为100 μL。细胞培养过夜贴壁后，用含有20 μmol/L的辛伐他汀(辛伐他汀组)、10-7mol/L紫杉醇(紫杉醇组)及含两药的培养液(联合组)各100 μL培养细胞24、48 h后用MTT法测吸光度值A，计算细胞增殖抑制率。增殖抑制率=[1-(处理组A值-空白组A值)/(阴性组A组-空白组A组)]×100%。

12.4 辛伐他汀联合紫杉醇对A549/Taxol细胞周期的影响的观察 将A549/Taxol细胞制成单细胞悬液，以每孔1×105个细胞接种6孔平底培养板中，细胞培养过夜贴壁后分别用20 μmol/L的辛伐他汀(辛伐他汀组)、10-7mol/L紫杉醇(紫杉醇组)及20 μmol/L辛伐他汀+10-7mol/L紫杉醇(联合组)各100 μL处理细胞24、36、48 h。收集各组细胞及正常培养的A549/Taxol细胞(正常对照组)，调细胞密度为l×106/mL，PBS漂洗细胞2次，加入含RNA酶的碘化丙啶(PI)150 μL避光染色30 min，用流式细胞仪检测细胞周期，计算每个阶段细胞所占的比例。

2 结果

2.1 辛伐他汀对A549/Taxol细胞增殖的影响 不同浓度的辛伐他汀处理后A549/Taxol细胞增殖抑制率见表1。随辛伐他汀浓度的升高，增殖抑制率逐渐升高(P均<0.05)。相同浓度辛伐他汀分别处理A549/Taxol细胞24、36、48 h后，抑制率随时间延长逐渐升高(P<0.01)。辛伐他汀对细胞株有明显的抑制增殖作用，且呈剂量依赖性和时间依赖性。

表1 不同浓度辛伐他汀对A549/Taxol细胞增殖的影响

2.2 辛伐他汀联合紫杉醇对A549/Taxol细胞增殖的影响 各组细胞培养24、48 h后细胞增殖抑制率见表2。紫杉醇组细胞培养48 h后细胞增殖更加活跃，证实A549/Taxol对紫杉醇耐药。联合组培养24、48 h后细胞增殖抑制率明显高于紫杉醇组和辛伐他汀组(P均<0.05)。

表2 辛伐他汀联合紫杉醇对A549/Taxol细胞增殖的影响

2.3 辛伐他汀联合紫杉醇对A549/Taxol细胞细胞周期的影响 各组细胞培养24、36、48 h后细胞周期分布见表3。由表3可见，辛伐他汀组各时点G1期细胞比例较空白对照组升高、S期细胞比例较空白对照组降低(P均<0.05)，且随培养时间延长G1期细胞比例逐渐升高、S期细胞比例逐渐降低(P均<0.05)。紫杉醇组各时点G1细胞比例与空白对照组相比差异无统计学意义，S期细胞比例高于空白对照组(P均<0.05)。联合组各时点G1期细胞比例较辛伐他汀组、紫杉醇组、空白对照组均升高、S期细胞比例较辛伐他汀组、紫杉醇组、空白对照组均下降(P均<0.05)。

表3 各组细胞培养24、36、48 h后细胞周期分布比较

3 讨论

紫杉醇是NSCLC临床治疗的一线用药。紫杉醇作用靶点是构成细胞骨架的微管，主要通过促进蛋白质组装成微管及阻止其解聚，将肿瘤细胞阻遏在G2期和M期，抑制有丝分裂，导致肿瘤细胞死亡。辛伐他汀结构中具有羟甲基戊二酸的活性结构，其作用靶点是羟甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶，是HMG-CoA还原酶抑制剂。HMG-CoA还原酶是胆固醇生物合成的主要限速酶，通过催化HMG-CoA合成甲羟戊酸(MVA)。Martinez等[5]证实洛伐他汀通过降低胆固醇合成抑制MVA途径，诱导多种肿瘤细胞停滞于G1期而抑制肿瘤细胞的增殖。此效应可因MVA和低密度脂蛋白(LDL)的加入而恢复细胞G1→S期的转换。

本研究结果显示，辛伐他汀具有抑制A549/Taxol肿瘤细胞增殖的作用，且呈浓度、时间依赖效应。10-7mol/L紫杉醇A549/Taxol肿瘤细胞增殖无明显影响。 20 μmol/L辛伐他汀联合10-7mol/L紫杉醇组对A549/Taxol细胞增殖的抑制作用，较紫杉醇、辛伐他汀单药抑制作用明显。辛伐他汀可以阻滞耐紫杉醇A549细胞于G1期并且随培养时间延长G1期细胞比例增加，提示辛伐他汀能够克服紫杉醇耐药。

Maksimova等[6]研究表明，他汀类药物阻滞细胞于G1/S期的抗增殖作用，可能是通过提高细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂如p21及p27水平发挥作用的。Cemeus等[7]研究发他汀类药物和吉非替尼两药联用能够克服NSCLC吉非替尼耐药，其机制可能是减少甲羟戊酸产物，抑制肿瘤细胞增殖。Park等[8]发现他汀类药物可增加伊立替康对NSCLC细胞A549和H460的细胞毒作用，通过提高细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21水平使细胞周期阻滞于G1期。辛伐他汀与培美曲塞联用，可以进一步激活恶性间皮瘤细胞和肺癌细胞Caspase-3、8、9的表达，增强Caspase家族介导的细胞凋亡，还可以通过提高促凋亡基因Bim、Puma，降低抑制凋亡基因Mcl-1、Bcl-xL的表达发挥促凋亡作用。两者联用还可以协同导致线粒体功能障碍[9]。本研究结果显示，辛伐他汀联合紫杉醇能克服人肺腺癌紫杉醇耐药，但其具体作用机制及信号途径仍需进一步探讨。我们将进一步研究达到相同的肿瘤抑制作用时辛伐他汀能否降低紫杉醇的用量，以降低治疗不良反应，提高治疗有效率。

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[7] Cemeus C, Zhao TT, Barrett GM, et al. Lovastatin enhances gefitinib activity in glioblastoma cells irrespective of EGFRvⅢ and PTEN status[J]. Neurooncol, 2008,90(1):9-17.

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济南市科技发展计划项目( 2013022)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.06.012

R734.2

B

1002-266X(2015)06-0034-03

2014-12-17)