三波长HPLC指纹图谱和7组分测定评价银黄片质量

夏俊美，孙国祥

(沈阳药科大学药学院，沈阳 110016)

三波长HPLC指纹图谱和7组分测定评价银黄片质量

夏俊美，孙国祥

(沈阳药科大学药学院，沈阳 110016)

目的 建立银黄片三波长高效液相色谱(HPLC)指纹图谱和7组分测定评价方法，为全面评价不同厂家银黄片质量提供依据。方法 采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法，Agilent Poroshell 120 SB C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，2.7 μm)，0.2%磷酸溶液-甲醇为流动相，线性梯度洗脱，流速为0.5 mL·min-1，柱温(35.00±0.15) ℃，紫外检测波长为214，278，326 nm，进样量5 μL，并用中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统4.0版软件对13批银黄片进行质量等级评价。以绿原酸、咖啡酸、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和野黄芩苷的含量作为评价指标，比较5个不同厂家银黄片的质量差异。结果 以黄芩苷为参照物峰，分别确定28(214 nm)、29(278 nm)和26(326 nm)个共有指纹峰，建立了银黄片高效液相色谱三波长指纹图谱。系统指纹定量法评价发现5个厂家的银黄片化学指纹含量差异较大。结论 不同厂家生产的银黄片质量差异较大，有必要建立多波长和多指标定量控制方法。该法为银黄片质量控制提供了新参考。

银黄片；三波长指纹图谱；7组分定量；系统指纹定量法；质量控制

单味中药或复方中药均是多种化学物质成分复杂体系。中药指纹图谱[1-2]作为多组分复杂样品整体评价中药质量的有效控制方法，是目前能被国内外广泛接受的全面评价中药质量模式[3]。笔者采用三波长色谱指纹图谱和7组分测定法对银黄片进行质量控制，使中药复杂体系在三波长下形成的指纹图谱尽可能实现每个化学指纹成分得到展现和控制，排除干扰从而强化指纹峰可辨识性，同时加大不同成分响应差异，避免单波长指纹图谱的片面性，使得非特征吸收的物质信息也得到了较全面的表达，以展示中药指纹图谱丰富的多维信息特征。7组分测定控制中药质量弥补了单一指标成分控制中药质量在表明中药整体质量信息及反映中药有效性和安全状况之处的不足，使得中药质量控制更加准确，更能反映中药质量状况，所对应的产品组成更加清晰，产品的质量和稳定性更加可靠。多波长色谱指纹图谱+多指标成分含量测定的控制模式[4-5]对产品质量的定量控制，能保证中药化学物质均一性、有效性和稳定性，并将成为中药质量控制的一种新型模式，具有重要的应用前景。

银黄片是《中药部颁药品标准》收载药品[6]，由金银花提取物和黄芩提取物制备而成，具有清热、解毒、抗菌消炎作用。用于急慢性扁桃体炎和急慢性咽喉炎。其质量标准无含量测定项，文献有测定银黄胶囊[7-8]、银黄口服液[9-10]、银黄颗粒[11-12]中一种或两种主要成分含量作为评价指标对不同厂家制剂进行质量差异比较。多波长色谱指纹图谱与多指标成分含量测定结合对银黄片质量进行评价，笔者未见文献报道。笔者采用高效液相色谱法以绿原酸(chlorogenic acid，CGA)、咖啡酸(caffeic caid，CFA)、黄芩苷(baicalin，BCL)、汉黄芩苷(wogonoside，WG)、黄芩素(baicalein，BCE)、汉黄芩素(wogonin，WN)和野黄芩苷(scutellarin，SLN)的含量做为评价指标，比较5个不同厂家银黄片的质量差异，结合3波长指纹图谱整体控制其质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1100 型液相色谱仪(DAD检测器，低压四元梯度泵，在线脱气和自动进样装置)，Chemstation工作站(Agilent科技有限公司)。KDM 型控温电热套(山东鄄城华鲁仪器公司)，RE-52型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，Sarturius-BS110S分析天平(北京赛多利斯天平有限公司，万分之一天平)，KS-120D超声波清洗器(宁波科生仪器厂)。

1.2 试药 CGA(批号：110753-200413)、CFA(批号：885-200001)、BCL(批号：110715-200212)、WN(批号：111514-200403)、SLN(批号：110842-200403)对照品均购自中国食品药品检定研究院，供含量测定用。BCE(批号：110705)、WG(批号：110802)对照品购自上海融禾医药科技有限公司。甲醇(购自山东禹王实业总公司)、磷酸(购自天津市科密欧化学试剂有限公司)均为色谱纯，供含量测定用。所用水为去离子水。

13批银黄片均为市售品，标号S1～S13，其中S1～S5、S6～S8、S9～S10、S11～S12和S13分别由不同厂家生产。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 取各对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度分别为0.4 mg·mL-1CGA，0.4 mg·mL-1CFA，1.9 mg·mL-1BCL，0.9 mg·mL-1BCE，1.8 mg·mL-1WG，2.3 mg·mL-1WN，1.0 mg·mL-1SLN的混合对照品溶液。

2.2 供试液的制备 取银黄片2片，精密称定，除去薄膜衣并研碎，取约0.48 g，精密称定，加甲醇20 mL，回流提取1 h，过滤，残渣加甲醇20 mL回流提取0.5 h，将所得滤液与前两次滤液合并，减压浓缩至6 mL，用甲醇定容至10 mL，摇匀，作为贮备液。将贮备液稀释为原浓度1/5作供试品溶液。

2.3 色谱条件 色谱柱为Agilent Poroshell 120 SB C18柱(4.6 mm×150 mm，2.7 μm)。流动相：A为0.2%磷酸溶液；B为甲醇。梯度程序： 0～7 min，7% B；7～10 min，7%→10%B；10～15 min，10%→15%B；15～20 min，15%→16%B；20～35 min，16%→31%B；35～45 min，31%→46%B；45～55 min，46%→55%B；55～70 min，55%→80%B；70～90 min，80%→100%B。流速为0.5 mL·min-1，柱温为(35.00±0.15) ℃，紫外检测波长分别为214，278，326 nm，进样5 μL，洗脱95 min。

2.4 指纹图谱条件优化 本实验以色谱指纹图谱指数(index of chromatographic fingerprints，F)作为优化目标函数，见(1)式。F反映指纹信号大小和信号均化程度(γ)及分离效率(β)高低，F值越大越好[13]。

实验分别以水(Water)、25%乙醇(EtOH)(V/V)、50%EtOH、75%EtOH、95%EtOH和甲醇(MeOH)为提取溶剂考察提取效率，采用洗脱程序有：A为0.2%磷酸溶液，B为甲醇。GEP1：0～7 min，7%B；7～10 min，7%→10%B；10～15 min，10%→15%B；15～20 min，15%→16%B；20～35 min，16%→31%B；35～45 min，31%→46%B；45～55 min，46%→55%B；55～70 min，55%→80%B；70～90 min，80%→100%B。GEP2：0～7 min，7%B；7～10 min，7%→10%B；10～15 min，10%→15%B；15～20 min，15%→16%B；20～35 min，16%→20%B；35～45 min，20%→22%B；45～60 min，22%→35%B；60～70 min，35%→48%B；70～80 min，48%→65%B；80～90 min，65%→85%B。考察了两种色谱柱，分别为Venusil XBP C18柱(Column 2)和Agilent Poroshell 120 SB C18色谱柱(Column 1)。记录278 nm及190～400 nm DAD谱图。计算并比较各条件下F，见图1。根据F大小最终确定以MeOH为提取溶剂，选择洗脱程序GEP1和用Agilent Poroshell 120 SB C18色谱柱。

2.5 系统适用性实验 取S6供试品溶液、CGA、CFA、BLN、BCE、WG、WN和SCL对照品溶液分别进样5 μL，记录3波长下的色谱图(图2)。比较保留时间及在线紫外光谱可知，214 nm检测的4，6，12，17，22，24和25号峰；对应278 nm检测的4，5，11，17，21，24和26号峰；对应326 nm检测的3，5，13，17，21，24和25号峰，分别为CGA、CFA、SLN、BCL、WG、BCE和WN。因黄芩苷峰响应值较大且与相邻峰分离较好，故选作参照物峰。考察此检测条件的2 h空针图中未见溶剂峰，2 h供试液色谱图中组分在95 min内出峰完全，确定洗脱95 min。

图1 银黄片HPLC指纹图谱在不同条件下F值

Fig.1 TheFvaluaes under different condition forYinghuangtablets HPLC fingerprints

图2 银黄片在214，278和326 nm的色谱图和CGA、CFA、BCL、WG、BCE、WN及SLN混合对照品HPLC图

Fig.2 HPLC chromatograms of Yinhuang tablets and mixed control of CGA，CFA，BCL，WG，BCE，WN and SLN at 214，278，326 nm

2.6 精密度实验 精密吸取S1供试液5 μL连续进样5次，记录色谱图。以BCL峰保留时间和峰面积为参照，计算3波长下各共有峰相对保留时间，RSD均<1.3%。各波长下各共有峰峰面积的RSD：214 nm时除1号和16号峰外，其余均<1.0%；278 nm时除7号、25号和29号峰外，其余各峰相对峰面积RSD均<2.5%；326 nm时除1号和23号峰外，其余RSD均<2.0%，表明进样精密度符合要求。

2.7 稳定性实验 分别在制备S1供试液后0，7，12，18，24 h进样测定，记录色谱图。以BCL峰保留时间和峰面积为参照，计算3波长下各共有峰相对保留时间，RSD均<2.0%。各波长下各共有峰峰面积的RSD：214 nm时除1号和8号峰外，其余均<1.0%；278 nm时除7，25和29号峰外，其余各峰相对峰面积RSD均<3.1%；326 nm时除1，16和23号峰外，其余RSD均<2.0%。表明样品在24 h内基本稳定。

2.8 重复性实验 取S1样品平行制备5份供试液，分别吸取5 μL进样测定，记录色谱图。以BCL峰保留时间和峰面积为参照，计算3波长下各共有峰相对保留时间RSD均<1.8%。各波长下各共有峰峰面积的RSD：214 nm时除1号和8号峰(1.5%)外，其余均<1.0%；278 nm时除7，25和29号峰外，其余各峰相对峰面积RSD均<3.7%；326 nm时除1，12，16和23号峰外，其余RSD均<2.0%。表明方法重复性良好。

2.9 线性关系考察 精密吸取此溶液5，2，1，0.5，0.1，0.02 mL分别置于10 mL量瓶，用甲醇定容，摇匀即得，按“1.4”项色谱条件测定。以进样量为横坐标，以峰面积为纵坐标进行线性回归，线性范围、线性方程及相关系数见表1。 结果表明CGA、CFA、SLN、BCL、WG、BCE和WN在各自线性范围内线性关系良好。

表1 7组分含量测定线性回归方程、线性范围及相关系数

Tab.1 Equation of linear regression, linearity range and correlation coefficient of content determination on seven constituents

化合物回归方程r线性范围/(μg·mL-1)CGAY=10．891X+4．53280．99993．8～1900CFAY=23．687X+5．56290．99991．8～900SLNY=22．965X-1．72210．99993．6～1823．5BCLY=30．481X+26．9920．99984．6～2300WGY=37．972X+21．0330．99982．0～1000BCEY=56．129X+0．33520．99990．8～400WNY=64．134X+22．6050．99980．8～400

2.10 加样回收率实验 精密称取已知含量的S1样品 6份，每份约0.5 g，分别准确加入CGA、CFA、SLN、BCL、WG、BCE和WN对照品适量，按“2.2”项方法制备各供试品溶液并在“2.3”项条件下测定。CGA、CFA、SLN、BCL、WG、BCE和WN平均回收率分别为97.2%，100.5%，95.9%，101.3%，99.1%，98.9%和99.0%，其RSD分别为1.8%，1.9%，2.1%，1.2%，1.6%，1.8%和2.0%，表明该方法准确度良好。

2.11 银黄片三波长指纹图谱建立与评价 考虑CGA、CFA、SLN、BCL、WG、BCE和WN各物质的最大吸光度，故选取3个检测波长214，278和326 nm。将13批银黄片供试液分别进样测定，记录色谱图(图3)。以黄芩苷峰为参照物峰，按峰出现率80%计，确定各检测波长下的共有指纹峰为：28(214 nm)，29(278 nm)和26(326 nm)。将13批样品的积分AIA信号导入中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统4.0软件[14]，按均值法计算生成准对照指纹图谱并计算13批样品的宏定性相似度(macro qualitative similarity，Sm)、宏定量相似度(macro quantitative similarity，Pm)和指纹均化变动系数(relative deviation of leveling coefficient，α)，并以Sm、Pm和α为指标，用SPSS19.0版软件对13批样品进行聚类分析。结果S6-S9和S13为第Ⅰ类，S1-S5、S10-S12为第Ⅱ类，选第I类5批样品指纹谱，按均值法重新生成三波长下对照指纹图谱(referential fingerprint，RFP)，见图3。

采用系统指纹定量法对银黄片复杂物质组分系统进行质量评价，用Sm整体鉴定样品化学指纹数量和含量分布比例与RFP差别，用Pm测定银黄片化学指纹整体含量与RFP的差异，用指纹变异系数α判定样品指纹与RFP指纹的同态性，见(2-4)式。13批样品的Sm、Pm、α及质量等级见表2，按SQFM鉴别出S6-S9及S13质量等级都在3级(Good，好)以上，除326 nm下S13质量等级为6级(Common，一般)外，其余质量均为劣。这主要是由于各批次Pm值过大或过小而引起的，表明银黄片中药效物质含量差异较大。

2.12 样品测定 分别精密吸取供试品5 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。将所得的峰面积代入标准曲线，计算CGA、CFA、SLN、BCL、WG、BCE和WN 含量，结果见表2。结果表明不同厂家及同一厂家不同批次样品中各物质含量有显著差异(图4)。

3 讨论

本实验通过三波长色谱指纹图谱和7组分测定的控制模式，采用系统指纹定量法评价银黄片质量并建立了快速测定不同厂家银黄片中CGA、CFA、BCL、WG、BCE、WN和SLN7种成分含量的分析方法。结果表明方法简单，快速，准确，为本制剂的质量控制提供了新参考。不同厂家、不同批号的制剂中各物质含量相差甚大，而各厂家药品服用量却是相同的，这是临床用药疗效差异的主要原因之一，建议统一该制剂的质量标准。

A.214 nm；B.278 nm；C.326 nm

滤长参数S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12S13214nmSm0．790．880．890．850．870．980．980．980．980．810．700．650．86Pm11．713．715．915．615．6106．397．0106．8107．848．519．02．681．2α0．700．530．500．540．380．020．010．020．020．490．470．990．02等级8888821228883质量劣劣劣劣劣较好最好较好较好劣劣劣好278nmSm0．780．760．820．800．860．980．980．980．970．930．820．710．86Pm10．613．115．114．715．1106．395．3105．6107．245．718．72．384．3α0．620．540．500．520．390．040．010．000．030．460．530．850．06等级8888821228883质量劣劣劣劣劣较好最好较好较好劣劣劣好326nmSm0．790．830．830．840．850．970．980．980．970．860．740．750．83Pm11．713．315．714．714．0112．199．2111．4111．853．416．82．363．2α0．330．300．300．300．220．020．030．040．010．370．300．400．22等级8888831337886质量劣劣劣劣劣好较好好好缺陷劣劣一般含量CGA2．1551．9052．3231．9671．2989．0258．22410．1488．8079．2261．6010．4640．198(mg·g-1)CFA0．1090．0920．1020．0900．0621．2991．0511．1401．1441．1630．0310．0320．082SLN0．0770．0880．0960．0960．0980．1930．3090．2980．0980．0310．0440．0120．263BCL1．2691．6261．9271．8522．02716．77514．15016．10717．7456．0322．9470．28213．589WG0．2200．3200．3610．3450．3790．2290．1160．1410．4060．6610．4710．0822．560BCE0．2000．2790．3190．3460．3340．5680．9201．1150．9850．9561．1130．0250．943WN0．0480．0800．0840．0970．0770．0890．1100．1400．0930．1210．2930．0170．310

图4 13批银黄片样品中7组分含量曲线图

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DOI 10.3870/yydb.2015.03.024

Quality Evaluation ofYinhuangTablets via Digitized and Quantified Fingerprints by High Performance Liquid Chromatography and Seven Components Detection

XIA Junmei， SUN Guoxiang

(CollegeofPharmacy，ShenyangPharmaceuticalUniversity，Shenyang110016，China)

Objective To establish the quality control ofYinhuangtablet (YHT) by using sever ingredients determination and tri-wavelength fingerprint analysis technologies. Methods The chromatographic fingerprints were developed by using Agilent Poroshell 120 SB C18(4.6 mm×150 mm， 2.7 μm) as the separation column and 0.2% H3PO4-methanol as the mobile phase.The flow rate was 0.5 mL·min-1， the UV absorbance was monitored at 214， 278 and 326 nm by injecting 5 μL of the sample solution and the column temperature was maintained at (35.00±0.15) ℃.The chromatographic fingerprints were characteristically evaluated for quality ranking of 13 batches of YHT by the 4.0 software of the digitized evaluation system of traditional chinese medicine fingerprint with the super information characteristics.Seven marker compounds including chlorogenic acid， caffeic acid， baicalin， wogonoside， baicalein， wogonin and scutellarin were simultaneously determined to compare the variation among five different manufacturers. Results The tri-wavelength fingerprint high performance liquid chromatography method was established.A total of 28(214 nm),29(278 nm)and 26(326 nm)common peaks were identified at respective wavelengths, using baicalin (BCL) as the referential peak.The software was applied to evaluate the YHT-HPLC fingerprints and identify the quality of 13 batches of YHT by systematically quantified fingerprint method (SQFM).The results showed that the content from the different manufacturers varied greatly. Conclusion The quality of YHT varies between different makers, and is necessary to establish the criterion for quality control.This method can provide a new reference for the quality control of YHT.

Yinhuangtablet; Tri-wavelength fingerprint; Seven ingredients quantification; Systematically quantified fingerprint method；Quality control

2014-01-07

2014-02-10

夏俊美(1986-)，女，内蒙古赤峰人，在读硕士，研究方向：中药指纹图谱研究。E-mail：xiajunmei1@163.com。

孙国祥(1962-)，男，辽宁凌源人，教授，博士生导师，研究方向：中药指纹学体系及其信息学研究。电话：024-23986286，E-mail：gxswmwys@163.com。

R286；R927.1

B

1004-0781(2015)03-0371-06