免疫比浊法与离子交换层析微柱法测定糖化血红蛋白的方法学比较

杨 军

(四川省自贡市第四人民医院检验科，四川 自贡 643000)

免疫比浊法与离子交换层析微柱法测定糖化血红蛋白的方法学比较

杨 军

(四川省自贡市第四人民医院检验科，四川 自贡 643000)

目的 对免疫比浊法与离子交换层析微柱法定量检测糖化血红蛋白(HbA1c)进行方法学比较。方法 采用免疫比浊法和离子交换层析微柱分别对同一标本做HbA1c含量检测，比较两种方法的精密度、准确性、线形范围、相关性和单位样本测定时间。结果 免疫比浊法精密度和重复性较好，与离子交换层析微柱法差异无统计学意义(P> 0.05)；免疫比浊法和离子交换层析微柱法具有较高相关性(r=0.9540，P< 0.01)。测得正常组、糖尿病A组、糖尿病B组的HbA1c值差异有统计学意义(P< 0.05)。结论 两种方法测定HbA1c均具有较高的精确度和重复性，但免疫比浊法操作更简单，要求标本量少，可作为自动化检测HbA1c的首选方法。

糖化血红蛋白；免疫比浊法；离子交换层析微柱

糖尿病的检测指标有血糖测定、尿糖测定、OGTT等，而糖化血红蛋白(glycosylated hemoglobin，HbA1c)作为糖尿病长期监测指标日益受到重视[1]。HbA1c是由血红蛋白(hemoglobin，Hb)β链氨基末端颉氨酸残基与葡萄糖醛基非酶促反应缩合而成，糖尿病时可占Hb总量的8%～30%。其糖链结构为α2(β-G)2，半衰期为60天，其形成取决于血糖浓度和作用时间，与血液中葡萄糖浓度成正比，可反映患者近2～3月血糖水平。故HbA1c检测对糖尿病的诊断和治疗有重要价值。离子交换层析微柱法为目前检测HbA1c的主要方法，但其方法比较烦琐、费时，而且成本比较高。本研究采用免疫比浊法检测HbA1c，并与离子交换层析微柱法比较。

1 对象与方法

1.1 检测对象 经临床确诊的本院门诊和住院糖尿病患者50例(糖尿病组)，均符合1985年WTO的诊断标准，其中男26例，女24例，年龄(48±14.3)岁，空腹血糖6.8～12.0 mmol/L者33例(A组)，>12.0 mmol/L者17例(Β组)。同期健康体检者(正常组)50例，排除糖尿病、肝病和其他内分泌疾病，男27例，女23例，年龄(34.53±7.49)岁。

1.2 仪器与材料 HbA1c免疫比浊法试剂盒为Tina-quant，HbA1c(Roche，批号为1822039)，试剂成分为HbA1c抗体、HbA1c多聚半抗原及缓冲液等。标准品由Roche提供。微柱法测定试剂(Biosystem提供)主要成分为低离子强度弱酸性阳离子交换树脂微柱，洗脱液(洗脱液A：磷酸盐缓冲液pH 7.0；洗脱液B：磷酸盐缓冲液pH6.7)以及溶血素组成。主要仪器有Biosystem BTS 330分光光度计，全自动生化分析仪OLYMPAS 2700。

1.3 方法 ①免疫比浊法：取溶血剂于室温放置几分钟。毛细血管血20 μl和2.0 ml溶血剂或肝素(EDTA)抗凝血10 μl和溶血剂1.0 ml，轻摇混匀1～2分钟后待混合物变为浅褐色可用。取溶血标本0.5 ml上机操作。HbA1c%=(HbA1c含量/总Hb含量)×100%。②离子交换层析微柱法：所有试剂及标本于室温放置10分钟。取EDTA抗凝血50 μl和溶血剂200 μl充分混匀制成Hb溶液，将此溶液50 μl加入预先沉淀好的微柱中，200 μl洗脱液A预洗，再加洗脱液A 2.0 ml洗脱。最后用洗脱液B 4.0 ml收集并以去离子水调零在415 nm处测定吸光度值AHbA1c。取溶血样品10 μl加上洗脱液B 2.4 ml，混匀，去离子水调零在415 nm处测定吸光度值AHbTOTAL。HbA1c%=AHbA1c/(3×AHbTOTAL)×100%

2 结果

2.1 HbA1c测定结果 如表1所示，两种方法均显示糖尿病A、B组HbA1c明显高于正常组(P< 0.05)，但A、B组之间差异无统计学意义(P> 0.05)。

表1 3组HbA1c测定结果 (%)

﹡与正常组比较，P< 0.05

2.2 线性范围 取已知浓度的标本作等比稀释并作相关分析，HbA1c的检测范围：免疫比浊法为6～20 g/L，离子交换层析微柱法为8～24 g/L，Hb的检测范围前者为60～200 g/L，后者为50～180 g/L。当Hb含量正常时HbA1c的线形范围是前者2%～20%，后者3%～18%。

2.3 精密度 正常人和糖尿病患者抗凝血各一份，HbA1c分别为(5.98±0.09)%、(9.40±0.11)%，分别重复测定20次，批内CV值：免疫比浊法为1.40%和1.15%，离子交换层析微柱法为1.5%和1.3%。两份EDTA抗凝血，HbA1c分别是(5.04±0.12)%和(8.62±0.15)%，各分装20份4 ℃保存，每天测各一次，连续测定10天，结果日间CV值：免疫比浊法为2.82%和2.57%，离子交换层析微柱法为2.97%和2.74%。免疫比浊法符合精确实验方法标准。

2.4 准确性 HbA1c分别为4.8%、6.9%、10.7%的三份低、中、高标本中加入HbA1c标准品0.83 g/dl和2.54 g/dl重复测定三次：免疫比浊法、离子交换层析微柱法的平均回收率分别是100.4%和100.9%。

2.5 方法学比较 对结果进行数据统计，得出回归方程。免疫比浊法与离子交换层析微柱法得出的结果一致。经过相关处理，其相关系数r=0.9540，P< 0.01，回归方程为Y=0.9405X+0.0205。

2.6 单位样品测试时间 准备时间：免疫比浊法与离子交换层析微柱法分别要1～2 min和15～20 min；实验时间：各需要10 min和165～215 min。

3 讨论

HbA1c作为糖代谢的长期监测指标重要性毋庸质疑，测定方法有多种如离子交换树脂微柱层析法、高压液相法、琼脂凝胶电泳法、等电点聚集法、亲和色谱微柱法、放射免疫法、离子捕获法、等电聚焦与毛细电泳系统、TBA比色法、电泳质谱测定法(ESMS)、不连续亲和电泳法等，不同的方法测定的HbA1c值不尽相同，可比性较差[2]。HbA1为HbA1a、HbA1b、HbA1c等亚单位的混合物，HbA1c为主要成分。测定过程中存在众多干扰因素(FHb、HbE、HbH、HbS、遗传变异Hb及其降解产物)。随着生活条件的改善，糖尿病的发病率在逐年上升，对于糖尿病的诊断和治疗及疗效观察，建立一种处理标本简便、速度更快、重复性好、尤其是特异性高、干扰因素少从而满足临床需要的方法势在必行。

免疫比浊法是应用小鼠单克隆抗Hbβ链糖化氨基末端的特异性抗体与标本中的HbA1c作用形成抗原-抗体复合物，再通过多聚半抗原与剩余的抗Hb抗体结合形成一种较稳定的多聚半抗原-抗体复合物，在531nm波长测定时吸收增加，形成浊度。反应液浊度的变化与标本中的HbA1c的浓度成反比，通过标准曲线测得HbA1c的值。另采用氰化高铁法测定标本中Hb总量，并计算HbA1c占Hb的百分比。离子交换层析微柱法是利用带有负电荷的低离子强度弱酸性阳离子交换树脂与带正电荷的Hb及HbA1c有亲和力，但由于HbA1c的两个β链N末端被糖基清除，正电荷较Hb少，两者对树脂的亲和力不同。用磷酸缓冲液过柱，最后用高离子强度分离试剂分离HbA1c，在415 nm波长测定，并计算HbA1c占Hb的百分比。

两种方法的批间CV值和批内CV值均小于1.5%和5%，已经达到美国国立医院建立的HbA1c的检测标准[3]，可以作为糖尿病患者的检测手段。离子交换层析微柱法作为临床上常用的方法，无需要贵重仪器设备，可以被大多数临床实验室接受且与参比方法相关性较好。但是操作完全依赖手工，费时费力，检测易受HbF、HbS的影响[4]，且检测时受到温度的影响较大，每次测定都需要作标准对照管。免疫比浊法适用于自动化分析、速度快、标本处理简单、适应临床上越来越多的标本的需要，与参比方法HPLC具有高度相关性[5]。

免疫比浊法与离子交换层析微柱法平行测定发现本组实验免疫比浊法测定值偏低，正常对照组免疫比浊法与离子交换层析微柱法分别是(4.87±0.37)%和(5.32±0.41)%；糖尿病A组是(9.23±0.41)%和(9.23±0.41)%；B组是(11.02±0.43)%和(11.15±0.47)%。除去方法学上的差异外，重要的原因是免疫比浊法是应用抗Hbβ链糖化氨基末端的特异性抗体与标本中的HbA1c作用形成抗原-抗体复合物，再通过多聚半抗原与剩余的抗Hb抗体结合形成一种较稳定的多聚半抗原-抗体复合物，形成浊度。因此对于N末端的顺序特异性要求更高。且研究表明其不受HbA2、HbS、HbF、遗传Hb、HbE、HbH和HbC的影响[6～8]。

免疫比浊法的标本可以采用毛细血管采血，简单快捷，采血量少，可随机采血进行单个样本的测定，研究表明毛细血管血和静脉血HbA1c，其结果无差异[9]。因而极大地方便了医生和患者，可以使患者免于静脉穿刺的困难和痛苦，更适用于门诊和急诊的需要，方便老年和幼儿患者，对于正在输注葡萄糖液体以及各种昏迷休克等危重患者、妊娠糖尿病患者提供快捷准确的实验证据。

两种方法的单位标本时间的比较显示：免疫比浊法的标本预处理简便而时间短。实验的平均时间更是只有离子交换层析微柱法的10%，速度更快，效率更高，在临床标本日益增多的今天，前者无疑更具优势。因此采用免疫比浊法测定HbA1c，结果准确可靠、灵敏度高、稳定性强、不易受到干扰物质的影响，标本处理简单快捷、可以使用毛细血管取血、适合自动化分析，是适合目前临床需要的首选方法。

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R446.6

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1672-6170(2015)01-0100-03

2014-06-20；

2014-08-10)