D3卵裂期胚胎玻璃化冷冻技术在IVF实验室中的应用

葛 斌，杨智敏，刁 英，杨名慧，宫黎明，石 燕

(遵义医学院附属医院 生殖中心，贵州 遵义 563099)

技术与方法

D3卵裂期胚胎玻璃化冷冻技术在IVF实验室中的应用

葛 斌，杨智敏，刁 英，杨名慧，宫黎明，石 燕

(遵义医学院附属医院 生殖中心，贵州 遵义 563099)

目的 探讨玻璃化冷冻技术在人类卵裂期胚胎冻存中的应用价值。方法 回顾性分析本中心261个冷冻胚胎复苏周期，比较2种冷冻方法的胚胎存活率、完好率、妊娠率和种植率等数据。结果 玻璃化冷冻组的存活率(97.11%)、完好率(89.02%)和种植率(23.12%)显著高于程序化组(91.31%、63.73%、16.31%)(P<0.05)，而妊娠率和平均年龄、平均移植胚胎数、平均内膜厚度两组间无统计学差异(40.26%vs40.22%、31.3±5.3vs32.2±5.5、2.25±0.55vs2.27±0.70、8.9±1.1vs9.1±1.6) (P>0.05)。结论 玻璃化冷冻是卵裂期胚胎保存的优选方法。

卵裂期胚胎；玻璃化更冷冻；程序化冷冻

卵裂期胚胎冷冻是辅助生殖技术中不可缺少的重要组成部分，它可以使患者在一个超排降调周期内进行多次移植，增加单次助孕周期的总妊娠率并能有效避免胚胎过度浪费[1]。实验室传统的程序化冷冻(programmed freezing)要求精密昂贵的设备,且操作过程繁琐，对液氮的消耗大。近年来出现的玻璃化冷冻(vitrified cryopreservation)技术已经被越来越多的生殖中心采用。玻璃化冷冻技术是利

用微小冷冻载体在极快速降温过程中使高浓度的冷冻液变成一种高粘度的介于液态与固态之间、非晶体、透明的玻璃态，达到冷冻保护的作用。与程序化冷冻相比，具有操作简单、耗时少、成本低等优点，但是否能得到理想的临床妊娠率和胚胎种植率，尚需要研讨。本研究回顾性分析本生殖中心261个复苏周期的各项实验室和临床指标，比较程序化冷冻和玻璃化冷冻对卵裂期胚胎的冷冻复苏效果。

1 资料与方法

1.1 一般资料 随机选取2014年2月至8月在遵义医学院附属医院生殖中心接受冻胚复苏移植(frozen thawed embryotransfer,FET)的患者261例645枚胚胎，根据冷冻方法不同分为两组：程序化冷冻复苏184个周期(472枚)，玻璃化冷冻复苏77周期(173枚)。

1.2 试剂和方法

1.2.1 胚胎冷冻 (1)程序化冷冻试剂实用Quinn′s冷冻培养基。冷冻方法：①脱水程序(室温下)：胚胎转移在溶液Ⅰ(HEPES-HTF+20%SPS)、溶液Ⅱ(0.5M PROH)、溶液Ⅲ(1.0M PROH)中各停留5 min,溶液Ⅳ(1.5M PROH)停留10 min，溶液Ⅵ(1.5M PROH-0.1M蔗糖)停留5 min。②胚胎装载与上机：将胚胎装入脉管中放入冷冻仪中，从室温以-2 ℃/min速率降至-7 ℃，保持5 min后行人工诱导结晶(植冰)，以-0.3 ℃/min降至-30 ℃，再以-50 ℃/min速率降至-150 ℃，停留10 min后投入液氮保存。(2)玻璃化冷冻试剂实用日本KITAZATO试剂盒。冷冻方法：①胚胎平衡(37℃)：将胚胎转移到Ⅰ号液体停留1 min(HEPES-HTF+20%SPS)，②胚胎脱水并装载(37 ℃)：将胚胎在Ⅱ号溶液(Equilibration Solution,ES)中停留2 min，再转移至Ⅲ号溶液(Vitrification Solution,VS)停留不超过1 min后装载到载杆上直接投入液氮保存。

1.2.2 胚胎解冻 (1)程序化解冻方法：①反脱水程序(室温下)将从液氮中取出的胚胎先后放入解冻溶液Ⅱ(1.0M PROH-0.2M蔗糖)、溶液Ⅲ(0.5M PROH-0.2M蔗糖)、溶液Ⅳ(0.2M蔗糖)中各停留5 min，溶液Ⅰ(HEPES-HTF+20%SPS)中停留10 min。②升温：将含有胚胎的解冻培养基从室温缓慢升至37℃(在大恒温板上进行)，行激光辅助孵化后放入37 ℃、5%CO2培养箱中等待移植。(2)玻璃化解冻方法(37 ℃下进行)：将胚胎从液氮罐中取出以此放入溶液Ⅰ(0.5M蔗糖)和溶液Ⅱ(0.35M蔗糖)中各停留1 min，溶液Ⅲ(0.25M蔗糖)中停留3 min，溶液Ⅳ(HTF+HSA)中停留5 min并洗涤数次，行激光辅助孵化后放入37 ℃、5%CO2培养箱中等待移植。

1.2.3 观察指标 胚胎存活率：存活胚胎数(卵裂球存活数目≥50%即为存活)/解冻胚胎数×100%；胚胎完好率：完好胚胎数(所有卵裂球都存活)/解冻胚胎数×100%；妊娠率：临床妊娠周期数/移植周期数×100%；种植率：妊娠胚胎数/移植胚胎数×100%。

1.3 统计学分析 数据均采用SPSS11.0统计学软件进行处理，均数间比较用t检验，率之间用2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组间临床资料对比 2014年2月至8月共解冻261个周期，程序化解冻184个周期，平均年龄32.2±5.5岁，玻璃化解冻77个周期，平均年龄31.3±5.3岁，组间年龄差异无统计学意义(P>0.05)；程序化解冻周期平均内膜厚度8.9±1.1 mm，玻璃化解冻周期平均内膜厚度9.1±1.6 mm，组间内膜厚度无统计学差异(P>0.05)；程序化解冻平均移植胚胎数2.27±0.70个，玻璃化解冻平均移植胚胎数2.25±0.55个，组间平均移植个数差异无统计学意义(P均>0.05，见表1)。

表1 程序化冷冻组与玻璃化冷冻组临床资料对比

组别例数年龄(岁)内膜厚度(mm)平均移植数(个)程序化冷冻18432．2±5．59．1±1．62．27±0．70玻璃化冷冻7731．3±5．38．9±1．12．25±0．55

与程序化冷冻比较,P均>0.05。

2.2 两组间实验室资料对比 程序化解冻胚胎472枚，存活胚胎数431枚，存活率为91.31%，玻璃化解冻胚胎数173枚，存活胚胎数168枚，存活率为97.11%，两组间存活率差异有统计学意义(P<0.05)；程序化解冻胚胎完好数310枚，完好率63.77%，玻璃化解冻胚胎完好数154枚，完好率89.02%，两组间完好率差异有统计学意义(P<0.05)；程序化解冻妊娠周期74例，妊娠率40.21%，玻璃化解冻妊娠周期31例，妊娠率40.26%，两组间妊娠率差异无统计学意义(P>0.05)；程序化解冻种植胚胎数77个，种植率16.31%，玻璃化解冻胚胎种植数40个，种植率23.12%，两组间种植率差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。

表2 程序化冷冻组与玻璃化冷冻组实验室资料对比

组别例数存活率(%)完好率(%)妊娠率(%)种植率(%)程序化冷冻47291．3163．7340．2216．31玻璃化冷冻17397．11∗89．02∗∗40．2623．12∗PP<0．05P<0．05P>0．05P<0．05

*P<0.05, **P<0.01,与程序化冷冻相比。

3 讨论

卵裂期胚胎冷冻保存是人类辅助生殖技术中一个极其重要的核心技术，它可以增加IVF累计成功率，预防严重卵巢过度刺激征，便于进行移植前胚胎遗传学诊断(PGD)技术的操作[2]。长时间来，IVF实验室一直采用程序化冷冻方法进行胚胎冻存，此方法是用程序降温仪缓慢使温度由室温降至-150℃，耗时长且液氮消耗量大，且冷冻过程中产生的冰晶会对胚胎造成很大损伤[3]。各生殖中心实验室均需要需找一种更好的冷冻方法来提高胚胎解冻后的存活率和完好率。因此，玻璃化冷冻技术应运而生，玻璃化冷冻技术原理是用高浓度的冷冻液将细胞内的水分置换出来，经过急速降温将由液态转化为类似玻璃状非晶体化状态，冷却过程中避免了冰晶形成对细胞质膜及细胞骨架结构的损伤，保留细胞体内外液体正常的分子和离子分布[4]。

Mukaida在1998年首次报道玻璃化冷冻人类卵裂期胚胎成功妊娠后，玻璃化冷冻技术在全球生殖中心IVF实验室内迅速被推广并应用。我国首例玻璃化冷冻胚胎并成功分娩在2004被王俊霞报道[5]。目前，玻璃化冷冻技术除了运用于冷冻卵裂期胚胎外，也被一些中心用作囊胚冷冻和卵子冷冻的主要方法[6]。有国外学者研究表明, 玻璃化冷冻 4c期胚胎其存活率显著比程序化冷冻高, 但临床妊娠率和胚胎种植率与程序化冷冻间无显著差异[7]，Balaban[8]也得到了相似的结果；但Mojtaba 等[9]在玻璃化法冷冻8 c期胚胎中发现着床率和临床妊娠率和程序化冷冻间有统计学差异，与Nina等[10]报道的结果一致。

本研究中，程序化冷冻组和玻璃化冷冻组之间的胚胎存活率、完好率和种植率均有显著差异(P<0.05)，这一结论与郑爱燕[1]等人的研究结果一致。玻璃化冷冻保护剂浓度高, 卵裂球脱水充分,另一方面由于温度快速下降,不易形成冰晶, 减少了胚胎或细胞的机械性损伤, 因此复苏胚胎存活率和完好率明显高于程序化组。而完好胚胎和存活胚胎提示具有较好的耐受冻融的能力,同时也反映了胚胎良好的发育潜能,这就解释了为何玻璃化冷冻的种植率高于程序化冷冻。但是妊娠率无显著差异(P>0.05)，分析原因可能由于本中心开展玻璃化冷冻技术时间较晚、数据较少等原因所致。

虽然玻璃化冷冻耗时少、成本低且能避免冰晶形成，理论上是胚胎冷冻的理想方法，但是在操作过程中含有胚胎的液滴直接与液氮接触，不能完全避免交叉感染的潜在风险[11-12]。而且玻璃化冷冻中高浓度冷冻保护剂不可避免会对胚胎造成细胞毒性损伤，程序化冷冻主要采用毒性较小、浓度较低的丙二醇作为胚胎冷冻的冷冻剂, 而玻璃化冷冻液里含有高浓度渗透性抗冻剂的DMSO,而DMSO具有很强的细胞毒性, 虽然DMSO能带来很好的冷冻效果,但是这种毒性作用对细胞能产生一定的损伤。Courtney等[13]发现玻璃化冷冻对鼠胚植入前的发育能力和种植潜能几乎没有影响。Takahashi 等[14]报道玻璃化冷冻分娩的婴儿发生生理缺陷概率与自然妊娠组无统计学差异。但是这些研究缺少大样本量的数据及对子代的长期随访。

综上，玻璃化冷冻是近年来开展的一种新的冷冻技术，冷冻效果优于程序化冷冻，但是对子代的长期随访报道很少，在玻璃化冷冻形成常规冷冻方法之前，有必要对子代做充分的后续研究和分析评估。

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[收稿2014-11-25;修回2015-01-20]

(编辑：王福军)

Application of D3 cleavage stage embryo vitrification freezing technology in IVF laboratories

GeBin,YangZhimin,DiaoYing,YangMinghui,GongLiming,ShiYan

(Reproductive Centre, The Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To explore the development potential of embryo and its breadboard outcome after cryopreservation with vitrification and programmed freezing methods.Methods In the retrospective study, a total of 261 frozen embryos were studied. The ratio of embryos survival, blastomere integrity, implantation and clinical pregnancy were compared between these two methods.Results Compared with the programmed frozen embryos, the Vitrified embryos had a higher survival rate (97.11% vs 91.31%), blastomere integrity rate (89.02% vs 63.73%) and implantation rate (23.12% vs 16.31%) (P<0.05). However, there was no significant difference in clinical pregnancy rate(40.26% vs 40.21%), the average number of transferred embryos (2.25±0.55 vs 2.27±0.70), the average age(31.3±5.3 vs 32.2±5.5)and the endometrial thickness (8.9±1.1 vs 9.1±1.6) between these two different freezing methods (P>0.05).Conclusion The outcome of vitrification is better than the programmed freezing method.

cleavage stage embryos; vitrification; programmed freezing

遵义医学院硕士启动基金资助项目(NO:2007-54)。

杨智敏，女，高级实验师，研究方向：辅助生殖技术，E-mail:yangzhimin8@126.com。

R321.3

A

1000-2715(2015)02-0193-04