固相微萃取⁃气相色谱／质谱技术在部分肠杆菌鉴定中的应用

黄冬薇 张德明 谭瑞星 郭振辉

固相微萃取⁃气相色谱／质谱技术在部分肠杆菌鉴定中的应用

黄冬薇 张德明 谭瑞星 郭振辉

目的应用固相微萃取⁃气相色谱／质谱联用技术（SPME⁃GC／MS）检测分析体外培养肠杆菌的挥发性有机物（VOCs），探讨SPME⁃GC／MS检测应用于肠杆菌菌种鉴别的可行性。方法取肠杆菌40株，培养24 h后，通过SPME⁃GC／MS技术收集并检测分析细菌培养产生的VOCs。结果40株肠杆菌检测出浓度较高的VOCs有14种，而乙酸在大肠埃希菌菌种的检出率为100%，在其余菌种中检出率为0，3⁃甲基⁃1⁃丁醇在肺炎克雷白菌种、十四烷醇酯在产气肠杆菌中检出率均为100%，在其余菌种中检出率均为0。3⁃甲基⁃1⁃丁醇，乙酸、吲哚，十四烷醇酯分别为肺炎克雷白菌、大肠埃希菌、产气肠杆菌的相对特异性VOCs。结论通过SPME⁃GC／MS技术可检测到部分肠杆菌的特异性VOCs，将其应用于肠杆菌菌种的鉴别具有可行性。

挥发性有机物；下呼吸道感染；固相微萃取；气相色谱／质谱

老年人是下呼吸道感染的主要群体，且感染患病率、病死率高，其原因与免疫和呼吸道防御功能减退、基础疾病多、营养状况差、容易误吸等因素相关，目前老年人下呼吸道感染常见的病原菌主要为革兰阴性杆菌，其中又以肺炎克雷白菌、大肠埃希菌等肠杆菌最为常见，而早期、准确的病原学诊断对下呼吸道感染的治疗至关重要［1⁃2］，但目前起始抗生素治疗往往缺乏可靠的病原学资料，通常为经验性治疗。因此，一种便捷、快速、无创的鉴别感染细菌菌种的方法对于抗生素准确、及时的应用有着重要的指导意义。近年来，有应用气相色谱／质谱联用技术（SPME⁃GC／MS）检测患者呼出气挥发性有机物（VOCs）以达到快速诊断结核菌感染的报道［3］，本研究则选取临床下呼吸道感染常见的肠杆菌科细菌作为研究对象，通过SPME⁃GC／MS检测分析体外培养肠杆菌VOCs，探讨该技术应用于细菌鉴别的可行性，并为进一步探讨SPME⁃GC／MS技术直接检测下呼吸道感染患者呼出气VOCs以鉴别感染病原菌的研究打下实验基础。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 取自我院检验科微生物室的肠杆菌科菌株40株，其中大肠埃希菌12株、肺炎克雷白菌12株、阴沟肠杆菌10株、产气肠杆菌6株，细菌菌株的分离和鉴定均由我院检验科微生物室按《全国临床检验操作规程（第2版）》进行，细菌鉴定采用法国Bio⁃Vitek自动化细菌鉴定仪进行鉴定。

1.2 仪器与试剂 血培养基；血液增菌培养液；0.45%盐水（Biomerieux Inc）磁搅拌子；双相血培养瓶（梅里埃公司）；恒温恒湿箱、比浊测定仪（VITEK DENSICHEK）；SPME手柄；75μm CAR／PDMS SPME萃取头；毛细管柱（INNOWAC 30 m×0.25 m×0.25 μm）；气⁃质联用仪（美国Voyager GC／MS）。

1.3 实验方法

1.3.1 细菌的增殖与培养：刮取所选细菌培养基上生长的菌落，于磨菌器内盐水研磨呈均匀的菌液，再加盐水稀释，通过比浊测定仪测定后，分别制成1.0 McFar⁃land混悬液。在无菌操作下打开培养瓶盖，将搅拌子放入其中，并在各培养瓶上分别标记各个细菌菌种和空白对照。将双相血培养瓶盖酒精消毒后，先将生理盐水3 ml注入空白对照瓶中，再用注射器取各细菌菌液3 ml注入已标记的培养瓶内，随后将培养瓶放入恒温恒湿箱中，培养24 h。

1.3.2 细菌培养瓶上层气体的采样浓缩：细菌培养液用磁力搅拌子中速搅拌，将SPME针管穿过样品瓶顶空瓶隔垫，伸入瓶中，将纤维头置于培养液上部，并在室温下顶空式萃取30 min。

1.3.3 细菌VOCs的分离与检测：实验采用GC／MS方法检测分析VOCs，吸附样品的SPME插入气相色谱／质谱进样口进行上样，GC／MS条件为HP25MS石英毛细管柱；载气为He，流速为1.0 ml／min，进样口温度250℃；程序升温：起始50℃，保持2 min，再以8℃／min升温至180℃，再以10℃／min升温至240℃，保持5 min；接口温度280℃；质谱扫描范围35～550 u；电子能量：70 V。

1.4 数据处理 将各细菌组检测得出的质谱图与空白对照的质谱图对比，筛选出有意义峰值，采用Wi⁃ley2713和Nist98谱库进行谱图检索。

2 结果

40株发酵菌共检测出浓度较高的VOCs有14种，检出的VOCs多为醇类及酯类物质，其中肺炎克雷白菌、大肠埃希菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌共同检出的成分有乙醇、1⁃葵醇、1⁃十二醇、顺式⁃9⁃十六碳单烯酸、1⁃十六醇。乙酸在大肠埃希菌菌种的检测率为100%，在其余菌种中检出率为0。3⁃甲基⁃1⁃丁醇在肺炎克雷白菌种、十四烷醇酯在产气肠杆菌中检出率均为100%，而在其余菌种中检出率为0，见表1。

表1 各细菌VOCs检出率（n，%）

3 讨论

GC／MS检测有着高选择性、高分离效能、高灵敏度、高速度等特点，在疾病的快速诊断方面有着很大的优势。近年来将GC／MS应用于疾病诊断的研究层出不穷，呼吸系统疾病的生化诊断长期滞后于机体其他器官，对于许多无法耐受有创检查的老年患者而言，无创、快捷的诊断方法的出现无疑可以提供极大的便利条件。目前通过GC／MS检测VOCs在细菌中的应用主要见于工业及环境监测领域，如检测食品及土壤中的细菌、真菌的VOCs［4⁃5］，亦有文献报道将气相色谱法应用于口腔、腹部厌氧菌感染的研究中［6］，2007年Phillips等［3］在肺结核患者的呼出气中检测到体外培养结核菌产生的特异性VOCs，应用该特异性气体来诊断肺结核有很好的敏感性及特异性。但将该方法应用于其他下呼吸道感染细菌的研究国内外文献少有报道。

近年来通过检测人体呼出气VOCs来反映机体的病理、生理状态成为研究的热点。研究范围涵盖了慢性炎症性疾病、恶性肿瘤、肾功能不全、器官移植排斥等疾病［7⁃9］。本研究以临床常见肠杆菌为研究对象，通过SPME⁃GC／MS可检测到肺炎克雷白菌、大肠埃希菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌的多种VOCs，多以醇类为主，各菌间有多种共同产生的VOCs及相对特异性的VOCs，在同类菌属中，各株检出的VOCs也不尽相同，细菌代谢产物的重叠以及各菌的个体差异使得分辨出细菌的特异性VOCs较为困难。实验中可检测到肺炎克雷白菌、大肠埃希菌、产气肠杆菌的相对特异性VOCs，但由于细菌样本量较小，检测细菌菌种不多，尚难确定这些VOCs是否为各细菌的标志性气体，后期如进一步扩大样本量并将检测菌种增加至革兰阳性菌、真菌等菌种，对于分析细菌的鉴别会更有意义。但SPME⁃GC／MS分析方法制定实验操作的标准化流程较难，由于实验条件的局限性，并未能在多种条件下比较检测条件的优势，因此仍有待进一步探索比较。

本实验通过SPME⁃GC／MS技术可检测出肺炎克雷白菌、大肠埃希菌、产气肠杆菌的相对特异性VOCs，这些相对特异性VOCs有助于细菌的鉴别，为进一步探讨SPME⁃GC／MS技术直接应用于检测下呼吸道感染患者呼出气VOCs的研究打下实验基础。但是，人呼出气中成分较为复杂，细菌VOCs在人体呼出气中含量极其微小，人体在感染状态时因氧化应激产生VOCs对细菌代谢物检测也有一定的干扰，因此VOCs检测在下呼吸道感染中的应用仍需大量的后续研究。

［1］ 蒋海平.老年患者革兰阴性杆菌性肺炎的菌群分布及耐药性［J］.中华医院感染学杂志，2012，22（10）：2209⁃2210.

［2］ 卓超.多重耐药时代经验性治疗的抗菌药物定位［J］.中国临床药理学杂志，2013，29（4）：280⁃292.

［3］ Phillips M，Cataneo RN，Condos R，et al.Volatile biomarkers of pulmonary tuberculosis in the breath［J］.Tu⁃berculosis，2007，87（1）：44⁃52.

［4］ Mauriello G，Capece A，D'Auria M，et al.SPEME⁃GC method as a tool to differentiate VOC profiles in Saccharomy⁃ces cerevisiae wine yeasts［J］.Food Microbiol，2009，26（3）：246⁃252.

［5］ Jonsson P，Gullberg J，Nordstrom A，et al.A strategy for i⁃dentifying differences in large series of metabolomic samples analyzed by GC／MS［J］.Anal Chem，2004，76（6）：1738⁃1745.

［6］ 刘瑞，唐岩，王本茂，等.应用气相色谱法快速诊断外科厌氧菌感染［J］.第二军医大学学报，1990，11（3）：229⁃232.

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［9］ Fens N，Zwinderman AH，van der Schee MP，et al. Exhaled breath profiling enables discrimination of chronic obstructive pulmonary disease and asthma［J］.Am J Respir Crit Care Med，2009，180（11）：1076⁃1082.

Application of solid⁃phase m icro⁃extraction and gas chromatography⁃mass spectrometry technique in identifying enterobacteriaceae

HUANG Dong⁃wei，ZHANG De⁃ming，TAN Rui⁃xing，GUO Zhen⁃hui．
The Third Department of Ger⁃ontology，General Hospital of Guangzhou Military Command of PLA，Guangdong Provincial Key Laboratory of Geriatric In⁃fection and Organ Function Support，Guangzhou 510010，China

ObjectiveTo detect the volative organic compounds（VOCs）of enterobacteriaceae cultured in vitro with solid⁃phase micro⁃extraction and gas chromatography⁃mass spectrometry（SPME⁃GC／MS）technique.MethodsForty samples of enterobacteriaceae were collected and cultured in the mycobottles for 24 hours，and the VOCs of the bacte⁃ria were detected and analyzed by SPME⁃GC／MS.ResultsFourteen main VOCs were detected from all bacteria，and the detection rate of acetic acid was 100%in escherichia coli group and 0 in other enterobacteriaceae groups.The detection rate of 1⁃butanol 3⁃methyl was 100%in klebsiella pneumoniae group and the detection rate of 1，14⁃Tetradecanediol was 100% in enterobacter aerogenes group，but the detection rate was 0 in other enterobacteriaceae groups.1⁃Butanol，3⁃methyl might be the specific VOCs for klebsiella pneumoniae，Acetic acid and Indole might be the specific VOCs for escherichia coli，and 1，14⁃Tetradecanediol for enterobacter aerogenes.ConclusionsThe specific VOCs of enterobacteria can be detected with SPME⁃GC／MS technique.The application of SPME⁃GC／MS technique in identifying enterobacteriaceae is feasible.

volative organic compounds；lower respiratory infections；solid⁃phase micro⁃extraction；gas chroma⁃tography⁃mass spectrometry

R 446.5

A

10.3969／j.issn.1003⁃9198.2015.01.014

2014⁃04⁃13）

广州市科技计划项目（2009Z1⁃E421）

510010广东省广州市，中国人民解放军广州军区广州总医院干部病房三科广东省老年感染与器官功能支持重点实验室