远隔缺血后适应对大鼠小肠缺血再灌注损伤的保护作用

李为明， 徐鹏远， 岑云云， 许青文， 孙大力， 李树民， 戚宇星， 李奕俊

昆明医科大学第二附属医院干疗外科，昆明 650101



实验研究

远隔缺血后适应对大鼠小肠缺血再灌注损伤的保护作用

李为明， 徐鹏远， 岑云云， 许青文， 孙大力， 李树民， 戚宇星， 李奕俊

昆明医科大学第二附属医院干疗外科，昆明 650101

目的 探讨远隔缺血后适应是否对大鼠肠道缺血再灌注损伤起保护作用。方法 健康雄性昆明种大鼠24只，随机分为假手术组(Con组)、缺血再灌注组(ischemia reperfusion，IR组)和远隔缺血后适应组(remote ischemic postconditioning，RIP组)共3组，每组8只。Con组只给予解剖游离肠系膜上动脉；IR组解剖出肠系膜上动脉，在肠系膜上动脉缺血60 min后再灌注120 min；RIP组在肠系膜上动脉缺血20 min后捆绑左下肢形成4个间隔5 min的循环缺血再灌注(共40 min)，再进行再灌注2 h。测定回肠组织中丙二醛(maleiedialdehyde，MDA)和髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)的含量；光镜下观察肠道组织形态学改变，对小肠黏膜损伤程度进行评分。结果 光镜下观察IR和RIP组有明显的肠道损伤，RIP组肠道损伤程度明显较IR组轻。小肠损伤按Chiu氏评分，RIP组Chiu评分值(2.10±0.63)明显低于IR组(3.20±0.76)(P<0.05)。IR和RIP组回肠组织中MDA和MPO含量明显高于Con组(均P<0.05)，而RIP组回肠组织中MDA及MPO含量明显低于IR组(均P<0.05)。结论 远隔缺血后适应对小肠缺血再灌注损伤具有显著保护作用，这种远隔器官缺血后适应可能是通过减轻活性氧损伤及炎症反应来保护肠道。

远隔缺血后适应； 小肠； 缺血再灌注

缺血预适应(ischemic preconditioning，IPC)和缺血后适应(ischemic postconditioning，IPostC)经过验证均可减轻缺血再灌注损伤。虽然IPC和IPostC对缺血再灌注损伤均具有保护作用，但其临床应用却都受到限制。IPC需要有缺血事件的预先警告，而在临床上无法预测缺血事件；IPostC可在缺血事件发生后实施，但对发生缺血的重要器官实施再缺血存在一定的临床风险，因此实施困难。相比之下，远隔缺血后适应(remote ischemic postconditioning，RIP)能通过实施于非重要器官来保护某些对缺氧缺血极其敏感的重要器官，并能在缺血事件发生后实施，更具有重要的临床应用价值。在国内外，远隔缺血后适应在心、脑、肾及肝方面有成功的动物实验[1-4]，但是在肠道方面国内外未见报道，本实验就远隔缺血后适应对大鼠小肠缺血再灌注损伤的保护作用进行研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

丙二醛(maleiedialdehyde，MDA)测定试剂盒、髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)测定试剂盒、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)，752型紫外分光光度计(Beekman Coulter，Ltd)，光学显微镜(日本OLYMPUS)。

1.2 实验动物及分组

健康雄性昆明种大鼠24只，体重180～200 g，由昆明医科大学动物实验中心提供，随机分为假手术组(Con组)、缺血再灌注组(IR组)和远隔缺血后适应组(RIP组)共3组，每组8只。Con组只给予解剖游离出肠系膜上动脉，不做缺血再灌注处理。IR组解剖出肠系膜上动脉，在肠系膜上动脉缺血60 min后再灌注120 min。RIP组在肠系膜上动脉缺血20 min后用弹力绷带捆紧左下肢5 min后放松绷带，形成4个间隔5 min循环的缺血再灌注(共40 min)，然后再进行再灌注2 h。

1.3 缺血再灌注模型制备

术前动物禁食12 h，自由饮水，5%水合氯醛腹腔麻醉，常规消毒皮肤后取腹正中切口4～5 cm，分离肠系膜上动脉(SAM)，以无损伤动脉夹夹闭其起始部60 min后松开血管夹，弹力绷带捆紧左下肢根部，再灌注后2 h处死动物并取材。

1.4 标本采集及检测指标

各组分别在恢复再灌注后2 h处死大鼠。①取部分回肠制备成10%组织匀浆，使用ELISA法检测回肠组织MDA及MPO，检测方法按说明书操作；②取一部分回肠组织用生理盐水冲洗干净浸泡于10%甲醛中备用。

1.5 肠道组织病理形态检测

取10%甲醛保存的回肠组织，经脱水透明、浸蜡、包埋，切成4 μm石蜡切片行苏木精-伊红(HE)染色，观察肠道组织形态学变化，肠黏膜损伤按Chiu氏[5]6级评分法分析。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 病理学观察

HE染色后Con组小肠绒毛排列整齐，绒毛完整，无出血坏死等明显改变(图1A)。IR组小肠绒毛破坏严重，绒毛水肿紊乱，肠上皮细胞坏死脱落，肠道间质有大量炎症细胞浸润，病理变化明显(图1B)。RIP组肠绒毛破坏及水肿程度明显减轻，病理变化介于Con组和IR组之间(图1C)。

2.2 远隔缺血后适应对肠组织病理损伤的影响

将肠黏膜组织行HE染色后，以双盲法按Chiu氏6级评分法评分，结果见表1。

A：Con组；B：IR组；C：RIP组

组别分值Con组0 00±0 00IR组3 20±0 76∗RIP组2 10±0 63∗﹟

与Con组比较，*P<0.05；与IR组比较，﹟P<0.05

2.3 各组大鼠肠道MDA及MPO含量变化

IR组和RIP组在灌注120 min后测定回肠组织中的MDA和MPO含量，均明显高于Con组(均P<0.05)，RIP组回肠组织中MDA和MPO的含量明显低于IR组(均P<0.05)，见表2。

组别MDA(nmol/mg)MPO(U/g)Con组3 12±0 160 46±0 21IR组12 38±0 29∗2 32±0 18∗RIP组6 78±0 19∗﹟1 20±0 21∗﹟

与Con组比较，*P<0.05；与IR组比较，﹟P<0.05

3 讨论

各种原因造成的局部组织器官缺血，使组织细胞供血不足而发生器官损伤，在一定条件下恢复血液再灌注后，组织器官细胞功能代谢障碍及结构破坏进一步加重，这种现象称为缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury，IRI)。自19世纪70年代便发现了IRI现象，虽然IPC和IPostC经动物实验证明对缺血再灌注损伤均具有保护作用，但其临床应用却都受到限制，至今仍未找到有效可行的治疗方法。远隔缺血后适应(RIP)是指重要器官长时间缺血再灌注前通过对非重要器官实施一次或几次短暂缺血再灌注来保护已发生缺血的重要器官。在国内外，RIP在心、脑、肾及肝方面有成功的动物实验[1-4]。绞窄性肠梗阻、坏死性小肠炎、肠系膜动脉栓塞、小肠移植、严重的腹部创伤以及各种休克都可以引起小肠IRI[6]。小肠是人体最大的免疫器官,也是最大的细菌及其毒素库，一旦小肠发生IRI，不但引起小肠正常的吸收功能障碍，而且由于小肠黏膜屏障破坏后引起大量的细菌、毒素及炎症因子进入血液循环还会引起全身炎症反应综合征，因此减轻小肠IRI是临床重要课题。本实验探讨RIP对大鼠小肠缺血再灌注损伤的保护作用。

本研究缺血再灌注动物模型采用Costa等[7]2014年报道的成功方法，即在重要器官缺血20 min后实施远隔器官4个循环的缺血再灌注，缺血60 min后再灌注2 h。实验中使用弹力绷带使左下肢缺血，方法简单实用，便于临床应用。经过2 h灌注后在光镜下观察小肠发现：RIP组较IR组肠绒毛破坏、上皮细胞坏死脱落、水肿程度及肠道间质炎症细胞浸润均有明显减轻，RIP组小肠损伤Chiu评分明显低于IR组，提示远隔缺血后适应对缺血再灌注所致的肠道功能和组织形态学损伤都有一定保护作用。

当小肠发生缺血再灌注损伤时，细胞内氧自由基大量生成可造成细胞膜和线粒体膜脂质过氧化，MDA是一种生物体脂质氧化的天然产物，通过检测MDA水平即可反映脂质氧化水平，因此MDA的测定被广泛用作脂质氧化指标，MPO是中性粒细胞的功能和激活标志。Li等[8]在RIP对心肌缺血再灌注损伤的保护实验中发现，心肌组织中MDA及MPO含量显著降低。而本实验结果显示：RIP组较IR组小肠组织MDA及MPO含量明显降低，提示RIP可减轻缺血再灌注所致的肠道过氧化损伤及炎性浸润。

通过本实验我们认为，小肠急性缺血再灌注前左下肢短暂缺血再灌注对小肠缺血再灌注损伤具有显著保护作用，这种远隔器官缺血后适应可能通过减轻活性氧的损伤及炎症反应来保护肠道。

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(2015-02-03 收稿)

Protective Effect of Remote Ischemic Postconditioning on Intestinal Ischemia-Reperfusion Injury in Rats

Li Weiming，Xu Pengyuan，Cen Yunyunetal

DepartmentofCadreSurgery，SecondAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity，Kunming650101，China

Objective To investigate the protective effect of remote ischemic postconditioning(RIP)on intestinal ischemia-reperfusion injury in rats.Methods Twenty-four male Kunming rats were randomly divided into 3 groups：sham operation group(Con)，ischemia-reperfusion group(IR)and remote ischemic postconditioning group(RIP).Animals in Con group only

the dissection of superior mesenteric artery.Animals in IR group were subjected to 60-min superior mesenteric artery ischemia followed by 120-min reperfusion.RIP consisted of 4 cycles of 5-min hind limb ischemia followed by 5-min hind limb perfusion，which was contemporaneous to the last 40-min superior mesenteric artery ischemia.After 2-h reperfusion，the ileum tissues were harvested for measurement of malondialdehyde(MDA)and myeloperoxidase(MPO).The intestinal morphological changes were observed.Scoring for the degree of intestinal mucosal injury was done.Results Light microscopy revealed that there were severe intestinal injuries in both RIP and IR groups.However，RIP group relative to IR group had significantly attenuated injuries.The Chiu score was(2.10±0.63)in RIP group，significantly lower than in IR group(3.20±0.76)(P<0.05).The concentrations of MDA and MPO were significantly increased in ileum tissues in both IR and RIP groups when compared with Con group(P<0.05).Those were significantly lower in RIP group than in IR group(P<0.05).Conclusion RIP protects against intestinal ischemia reperfusion injury in rats probably by reducing reactive oxygen injury and inflammatory response.

remote ischemic postconditioning； small intestine； ischemia-reperfusion

R574.5

10.3870/j.issn.1672-0741.2015.05.012

李为明，男，1976年生，主治医师，医学博士，E-mail：liweiming49@163.com