加味麻杏石甘汤对急性放射性肺炎大鼠Smad蛋白表达的干预作用

徐 佳林胜友

·论 著·

加味麻杏石甘汤对急性放射性肺炎大鼠Smad蛋白表达的干预作用

徐 佳1林胜友2

目的 明确加味麻杏石甘汤对大鼠急性放射性肺炎的干预作用，探讨其作用机制。方法复制急性放射性肺炎SD大鼠模型，按高、中、低剂量组分别给予加味麻杏石甘汤灌胃，阴性对照组、模型组予生理盐水灌胃，2mL/（220g·d），连续8周。各组分别于第2、4、8周随机处死4只大鼠，取肺组织，采用Western Blot方法检测大鼠肺组织P-Smad2、P-Smad3、Smad6、Smad7蛋白表达情况。结果 经照射后，模型组P-Smad2、P-Smad3表达上调（P均＜0.01），各用药组较模型组有不同程度下降（P均＜0.01）；模型组Smad6、Smad7表达下调（P＜0.01），各用药组较模型组有不同程度上升（P＜0.05，P＜0.01）。结论 加味麻杏石甘汤能下调急性放射性肺炎模型大鼠肺组织P-Smad2、PSmad3蛋白表达，上调Smad6、Smad7蛋白表达。

大鼠；急性放射性肺炎；加味麻杏石甘汤；Smad蛋白

胸部肿瘤放疗过程中，放射性肺炎发生率为5%～15%[1]，对肺功能有不同程度的影响。放射性肺损伤不仅限制放射治疗的实施，也降低患者的放疗效果和生存质量，甚至影响患者生存期。目前，临床多使用激素类、抗生素、抗氧化剂等药物治疗放射性肺炎，但疗效有限，且不良反应大，不宜长期使用。已有研究[2]证明，放射性肺损伤的发生和形成与TGF-β有密切关系，而Smad蛋白是TGF-β信号转导及调节过程中重要的细胞因子[3]。本研究拟通过建立急性放射性肺炎的动物模型，观察放疗后大鼠肺组织PSmad2/3、Smad6/7的表达水平，明确加味麻杏石甘汤对急性放射性肺炎的干预作用。

1 实验材料

1.1 实验动物 健康清洁级SD大鼠60只，雄性，体质量（220±20）g，上海西普尔-本凯试验动物有限公司提供，动物合格证号：SCXK（沪）2013-0016，饲养于浙江中医药大学动物实验中心。

1.2 药品与试剂 以大鼠重220g每日灌胃量为2mL计算，相当于正常人体的20倍剂量，将麻杏石甘汤（炙麻黄9g，苦杏仁12g，生石膏18g，生草6g，金银花9g等）加水浓煎至3g/mL。主要试剂：兔抗大鼠p-Smad2抗体（#3108，美国CST公司）、兔抗大鼠p-Smad3抗体（#9520，美国CST公司）、兔抗大鼠Smad6抗体（ab124890，美国Abcam公司）、兔抗大鼠Smad7抗体（ab13727，美国Abcam公司）、小鼠抗大鼠GAPDH抗体（Mab5465，杭州联科生物技术有限公司）、近红外燃料标记的二抗（鼠抗、兔抗，美国Li-Cor公司）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型，P0010S，上海碧云天生物技术有限公司）、PVDF膜（0803LK，联科生物技术有限公司）。

1.3 仪 器 多功能酶标仪（美国Thermo scientific公司Varioskan Flash and skanIt software）、小型垂直蛋白电泳仪（552BR021109，美国BIO-RAD公司）、红外激光双色成像系统（Odyssey CLx Infrared Imaging System，美国Li-Cor公司）、超低温冰箱（日本SANYO公司）。

2 实验方法

2.1 急性放射性肺炎大鼠模型建立[4]大鼠适应性喂养1周后，予编号，用随机数字法取12只作为阴性对照组，不予处理。剩余48只大鼠，以如下方法进行造模：大鼠在未麻醉状态下，腹部朝上，排列整齐，尽量使大鼠的肺部均位于一直线上，6只大鼠一架。用模拟定位机校准大鼠双肺位置，用瑞士医科达PreciseLINAC直线加速器（杭州市肿瘤医院提供）进行单次全胸照射大鼠双肺，用铅块屏蔽保护大鼠其余部分。照距SSD为100cm，总剂量20Gy。

2.2 分组与给药 模型成功建立后，根据给药剂量不同按随机数字法分为麻杏石甘汤高、中、低剂量组和模型组，每组12只。麻杏石甘汤高、中、低剂量组分别给予相当生药量为3、1.5、0.75g/mL的麻杏石甘汤灌胃（相当于正常成人体20、10、5倍剂量），2mL/（220g·d），连续8周。模型组和阴性对照组给予生理盐水灌胃，2mL/（220g·d），连续8周。分别于第2、4、8周随机各处死4只大鼠，取肺组织，保存于-80℃冰箱内备用。

2.3 Western Blot法检测肺组织P-Smad2/3、Smad6/ 7蛋白的表达 取大鼠肺组织，BCA法提取总蛋白并计算蛋白浓度。蛋白样品经SDS-PAGE电泳，转膜，封闭，一抗4℃孵育过夜，洗膜后二抗室温避光孵育。再次洗膜后将PVDF膜正面朝下置于红外激光双色成像系统，经Odyssey V3.0系统扫膜，成像于电脑。应用该软件测量条带灰度值，以GAPDH作为内参，灰度比=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

2.4 统计学方法 实验数据应用SPSS17.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组P-Smad2表达比较 Western Blot结果显示，阴性对照组大鼠各时间段P-Smad2蛋白均维持在一较低水平；经照射后模型组大鼠P-Smad2蛋白较阴性对照组表达升高，在第2周达到高峰（P＜0.01），第8周模型组较阴性对照组升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）；经加味麻杏石甘汤干预后，各浓度麻杏石甘汤组第2周、第4周和第8周时均较模型组降低（P＜0.01），其中，麻杏石甘汤低剂量组第4周低于高、中剂量组（P＜0.01），第8周时低于高剂量组（P＜0.01），中剂量组第8周低于高剂量组（P＜0.01）。见图1，表1。

图1 各组各时间段P-Smad2蛋白表达的变化

表1 各组各时间段P-Smad2灰度值比较（±s）

表1 各组各时间段P-Smad2灰度值比较（±s）

注：与阴性对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与高剂量组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与中剂量组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

阴性对照组模型组高剂量组中剂量组低剂量组33333 0.194±0.004 0.256±0.003##0.098±0.011** 0.106±0.007** 0.105±0.006** 0.037±0.003 0.052±0.003##0.034±0.003** 0.032±0.004** 0.017±0.002**△△▲▲0.038±0.002 0.041±0.003 0.021±0.003** 0.011±0.001**△△0.015±0.002**△△

3.2 各组P-Smad3表达比较 Western Blot结果显示，阴性对照组大鼠各时间段P-Smad3蛋白表达均维持在一较低水平；经照射后模型组大鼠P-Smad3蛋白表达较阴性对照组升高，在第2周达到高峰（P＜0.01）；经加味麻杏石甘汤干预后，高剂量组第2周、第8周低于模型组（P＜0.05），中、低剂量组各时间段均低于模型组（P＜0.01）；其中，中剂量组第2周、第4周、第8周均低于高剂量组（P＜0.01），第2周、第8周低于低剂量组（P＜0.05），高剂量组第2周低于低剂量组（P＜0.01），低剂量组第4周低于高、中剂量组（P＜0.01）。见图2、表2。

图2 各时间段各组P-Smad3蛋白的表达变化

表2 各组各时间段P-Smad3灰度值比较（±s）

表2 各组各时间段P-Smad3灰度值比较（±s）

注：与阴性对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与高剂量组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与中剂量组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

阴性对照组模型组高剂量组中剂量组低剂量组33333 0.506±0.006 1.253±0.005##0.666±0.005** 0.536±0.004**△△0.919±0.007**△△▲▲0.865±0.005 1.041±0.013##1.033±0.017 0.792±0.006**△△0.587±0.031**△△▲0.041±0.004 0.056±0.003##0.048±0.005* 0.038±0.002**△△0.046±0.004**▲

3.3 各组Smad6表达比较 Western Blot结果显示，阴性对照组大鼠各时间段Smad6均维持在一较高水平；经照射后模型组大鼠Smad6表达较阴性对照组下降，在第8周达到高峰（P＞0.05），第4周差异有统计学意义（P＜0.01）；经加味麻杏石甘汤干预后，高剂量组各时间段均较模型组升高，但差异无统计学意义（P＞0.05），中剂量组第8周高于模型组（P＜0.05），低剂量组第8周高于模型组（P＜0.01）；高剂量组第2周高于中剂量组（P＜0.01），中剂量组第8周高于高剂量组（P＜0.01），低剂量组第8周高于高剂量组（P＜0.01），第2周、第8周高于中剂量组（P＜0.05）。见图3、表3。

图3 各时间段各组Smad6蛋白的表达变化

表3 各组各时间段Smad6灰度值比较（±s）

表3 各组各时间段Smad6灰度值比较（±s）

注：与阴性对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与高剂量组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与中剂量组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

组别阴性对照组模型组高剂量组中剂量组低剂量组只数33333 2周1.677±0.194 1.613±0.247 1.677±0.23 1.052±0.303*△△1.712±0.097▲▲4周0.468±0.191 0.164±0.075##0.215±0.058 0.181±0.049 0.253±0.112 8周0.113±0.009 0.106±0.026 0.114±0.02 0.283±0.014**△△0.337±0.029**△△▲

3.4 各组Smad7表达比较 Western Blot结果显示，阴性对照组大鼠各时间段Smad7均维持在一较高水平；经照射后模型组大鼠Smad7表达较阴性对照组下降，在第8周达到高峰，但各时间段差异均无统计学意义（P＞0.01）；经加味麻杏石甘汤干预后，高剂量组第2周、第8周高于模型组（P＜0.01），中剂量组第2周、第8周高于模型组（P＜0.01），低剂量组第2周、第4周、第8周高于模型组（P＜0.05）；高剂量组第8周时高于低剂量组（P＜0.01），中剂量组第2周高于高剂量组、第8周高于低剂量组（P＜0.01），低剂量组第2周、第4周高于高剂量组（P＜0.05）。见图4、表4。

图4 各时间段各组Smad7蛋白表达

4 讨 论

放射性肺炎是指肺组织因大剂量放射性照射而引起的肺部急性炎性反应，是胸部肿瘤放疗最常见的并发症[5]，骨髓疾病中也可见。肺组织对放射性非常敏感，极易出现急性损伤，通常在放疗开始1～3个月后即出现，以发热、干咳、痰中带血、胸痛、憋闷等为主要临床表现。

表4 各时间段各组Smad7灰度值比较（±s）

表4 各时间段各组Smad7灰度值比较（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与高剂量组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与中剂量组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

组别阴性对照组模型组高剂量组中剂量组低剂量组只数33333 2周4.586±0.287 3.674±0.626 5.565±1.170** 9.631±0.566**△△8.525±0.50**△△4周0.431±0.261 0.270±0.347 0.400±0.184 0.563±0.131 0.939±0.444**△8周0.107±0.003 0.038±0.004 0.108±0.014** 0.122±0.021** 0.063±0.004*△△▲▲

Smad蛋白家族是细胞内重要的TGF-β信号转导和调节分子，而放射性肺炎的形成发展与细胞因子TGF-β1最为密切相关[6-7]。TGF-β通路通过其他细胞因子将信号传递至下游Smad蛋白[8]，从而影响细胞核内的基因表达。Smad蛋白家族包括受体调节型smad蛋白（Smad2、Smad3、Smad5、Smad8）、抑制型smad蛋白（Smad6、Smad7）和通用调节型Smad蛋白（Smad4）。Smad2、Smad3和（或）Smad4过度表达以及Smad6、Smad7被抑制可使TGF-β1持续激活。

麻杏石甘汤出自《伤寒论》，由麻黄、杏仁、石膏、炙甘草四味药组成。配伍严谨，清宣降三法具备，针对放射性肺炎急性期热毒攻伐、痰瘀互结之证，共奏清热解毒、宣肺平喘之效。多个临床研究[9-11]采用麻杏石甘汤为主的方剂治疗早期放射性肺炎，均取得较好地疗效。

本实验采用20Gy全胸照射建立大鼠急性放射性肺损伤模型。课题组前期研究[12-13]已多次运用单次全胸20Gy照射大鼠双肺成功复制放射性肺炎模型，且用HE染色病理组织学观察肺组织情况与文献[14-16]相符。

Smad2/3的磷酸化激活是TGF-β/Smad信号传导通路激活的最重要一步及标志，所以，P-smad2/3蛋白表达量即意味着TGF-β/Smad信号传导通路激活的程度[17]。本结果显示，P-smad2/3经照射后表达增强（P＜0.01）；加味麻杏石甘汤干预后，各加味麻杏石甘汤组p-smad2/3表达较模型组下调，其中加味麻杏石甘汤中剂量组起效时间较快，且效果持久。模型组Smad6/7表达较阴性对照组下降；经加味麻杏石甘汤干预后，各加味麻杏石甘汤组Smad6/7表达均有所上调，其中中剂量组对Smad7的干预中起效快且效果持久。

本实验结果证实，p-smad2/3、Smad6/7作为细胞因子参与放射性肺损伤的发生过程。加味麻杏石甘汤干预以后，各时间段P-smad2/3蛋白表达有所下降，Smad6/7蛋白表达有所升高，其中中剂量组起效快且药效持久，且与模型组相比大鼠整体情况有改善，证实加味麻杏石甘汤治疗急性放射性肺损伤有效，其机制可能与干预Smad蛋白的表达有关。但放射性肺损伤的发生机制尚未完全明确。加味麻杏石甘汤治疗放射性肺损伤的机制除了TGF-β/Smad通路以外是否尚存在其他信号通路等都值得进一步研究。

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（收稿：2015-06-06 修回：2015-08-13）

Intervention of Modified Maxing Shigan Decoction on Smad Protein Expression in Rats with Acute Radiation Pneumonitis

XU Jia1,LIN Shengyou2. 1 Department of Oncology,Xiaoshan First People's Hospital,Hangzhou (311200),China;2 Wushan Guoyiguan,Hangzhou Cancer Hospital,Hangzhou(311102),China

Objective To investigate the effect of modified Maxing Shigan decoction on rats with acute radiation pneumonitis and the underlying mechanism.Methods SD rat models of acute radiation pneumonitis were established.Rats were divided into modified Maxing Shigan decoction groups（high dose,middle dose,low dose）,control group,and model group.Modified Maxing Shigan decoction groups were intragastrically given 3,1.5,and 0.75g/mL（2mL/220g·d）of the corresponding drug for 8 weeks.Model group and control group were given equivalent volume of normal saline for the same period of time.Every 4 rats in each group were randomly sacrificed at 2,4,and 8 weeks to obtain lung tissue.The expressions of P-Smad2,P-Smad3,Smad6,and Smad7 proteins in lung tissue were analyzed by Western-blotting.Results After radiation,the expressions of P-Smad2 and P-Smad3 proteins in model group were up-regulated（P＜0.01）,while those in modified Maxing Shigan decoction groups were all downregulated（P＜0.01）.The expressions of Smad6 and Smad7 proteins in model group were down-regulated（P＜0.01）, while those in modified Maxing Shigan decoction groups were up-regulated（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion Modified Maxing Shigan decoction can down-regulated the expressions of P-Smad2 and P-Smad3 proteins and up-regulated the expression of Smad6 and Smad7 proteins in lung tissue of rats with acute radiation pneumonitis.

rats;acute radiation pneumonitis;modified Maxing Shigan decoction;Smad protein

国家自然基金资助项目（No.81174246）

1杭州市萧山区第一人民医院肿瘤科（杭州 311200）；2杭州市肿瘤医院吴山国医馆（杭州 310002）

林胜友，Tel：13505715111；E-mail：linsy0628@163.com