三叶木通叶斑病病原菌的生物学特性及生物防治

张 铮，李秀青，刘昱锋

（陕西师范大学生命科学学院，秦巴山区可持续发展协同创新中心，陕西西安710119）

三叶木通叶斑病病原菌的生物学特性及生物防治

张 铮，李秀青，刘昱锋

（陕西师范大学生命科学学院，秦巴山区可持续发展协同创新中心，陕西西安710119）

为明确三叶木通叶斑病病原菌的生物学特性，从培养基种类、碳源、氮源、pH、温度和光照等方面对三叶木通叶斑病病原菌细极链格孢（Alternaria tenuissima）的生物学特性进行了研究，并对其生物防治进行了初步探讨。结果表明：病原菌菌丝在PCA培养基，30℃，pH值为6，12h光照／12h黑暗的条件下生长较快；分生孢子在CA培养基，30℃，pH值为7，24h光照的条件下产孢量最大。该病原菌可利用多种碳源和氮源，菌丝的生长会受到硫酸铵和氯化铵的抑制。枯草芽孢杆菌SNUB16可显著拮抗三叶木通叶斑病病原菌的生长。

三叶木通；叶斑病病原菌；生物学特性；生物防治

三叶木通（Akebia trifoliata（Thunb.）Koidz）为木通科（Lardizabalaceae）木通属（Akebia Decne）多年生落叶木质藤本植物［1］，2010版药典将三叶木通藤茎和果实分别收录入木通和预知子药源，其藤茎具有利尿通淋，清心除烦，通经下乳的功效。果实具有疏肝理气，活血止痛等功效［2］。三叶木通多处于野生生长状态，近几年人工驯化栽培日益受到重视，但随着栽培面积的扩大，其生育期病害问题也日渐突出。目前对于木通科植物病害的报道有炭疽病、褐斑病、白粉病、叶斑病［3－6］。本实验室前期分离鉴定出三叶木通叶斑病病原菌为链格孢属细极链格孢（Alternaria tenuissima），是危害陕南地区三叶木通的主要病害之一，调查发现在陕南的种植地，连续三年部分区域三叶木通叶斑病严重，常造成叶片大量脱落甚至掉光，严重影响药材的生长和质量［6］。

生物防治是一种具有低毒、低残留、环境友好等特点的病害防治方法，利用自然界中的拮抗物对植物病害进行生物防治具有广阔的应用与发展前景。目前对链格孢属真菌的生物防治使用较多的有荧光假单胞菌（Psdeuomnodafluoerncnet）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis（Ehrenberg）Cohn）、化学诱导剂等。陶树兴等［7］人的研究表明枯草芽孢杆菌的一些优良菌株对多种植物病原菌具有拮抗作用。

基于以上原因，本研究对三叶木通叶斑病的主要致病菌细极链格孢的生物学特性进行分析和研究，并利用枯草芽孢杆菌对其生物防治进行了初步的探讨，旨在为该病害的进一步防治提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验菌株

三叶木通叶斑病病原菌：细极链格孢（Alternariatenuissima）［6］，本实验室分离保藏；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SNUB1、SNUB16［7］，由本院应用微生物学实验室提供。

1.2 培养基

供试培养基包括PDA（马铃薯葡萄糖培养基）、PSA（马铃薯蔗糖培养基）、PCA（马铃薯胡萝卜培养基）、CA（胡萝卜培养基）、CMA（玉米粉培养基）及Czapek（察氏培养基）。

1.3 实验方法

（1）平板菌种制备：从冰箱所保存的固体培养基上刮取一环菌体划线接种于平板培养基上，置于28℃的恒温生化培养箱内12h光照／12h黑暗培养，备用。

（2）接种培养：在无菌条件下，用打孔器打取直径为5mm的菌饼，挑取菌饼接种于培养基的中央，置于28℃的恒温生化培养箱内12h光照／12h黑暗培养。

（3）菌丝生长和产孢量的测定：接种后培养6d，测量菌落直径，每个处理3次重复；培养10d后测定产孢量，采用一定量无菌水制成孢子悬浮液，用血球计数板测定孢子浓度，并换算成孢子数量，孢子产生数量＝lg N，N为用血球计数器计算出来的孢子总数，每个处理3次重复。

1.4 生物学特性研究

参考王宏等［8］人研究梨黑斑病病原菌生物学特性的方法，研究不同培养基、碳源、氮源、pH值、温度、光照对三叶木通叶斑病病原菌的影响。

1.4.1 不同培养基对叶斑病病原菌菌丝生长和产孢的影响 将PDA（马铃薯葡萄糖培养基）、PSA（马铃薯蔗糖培养基）、PCA（马铃薯胡萝卜培养基）、CA（胡萝卜培养基）、CMA（玉米粉培养基）及Czapek（察氏培养基）分别制好平板后，接种菌片，培养并记录数据。

1.4.2 不同碳源对叶斑病病原菌菌丝生长和产孢的影响 采用Czapek培养基作为基础培养基，将相同质量的葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉、麦芽糖作为替换碳源，配制成含有不同碳源的培养基，并设缺碳对照，接种菌片，培养并记录数据。

1.4.3 不同氮源对叶斑病病原菌菌丝生长和产孢的影响 采用Czapek培养基作为基础培养基，将相同质量的苯丙氨酸、甘氨酸、乙酸铵、硫酸铵、氯化铵作为替换氮源，等量置换Czapek培养基中硝酸钾，配制成含不同氮源的培养基，设缺氮对照，接种菌片，培养并记录数据。

1.4.4 不同pH值对叶斑病病原菌菌丝生长和产孢的影响 PDA培养基灭菌后，用1moL／L盐酸和1moL／L氢氧化钠溶液将培养基的pH值分别调至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13，分别制好平板，接种菌片，培养并记录数据。

1.4.5 不同温度对叶斑病病原菌菌丝生长和产孢的影响 用PDA培养基平板接种菌片，分别置于5、10、15、20、25、30、35、40℃恒温生化培养箱培养，记录数据。

1.4.6 不同光照条件对叶斑病病原菌菌丝生长和产孢的影响 将菌片接于PDA培养基平板中央，分别置于24h全黑暗、24h全光照以及12h光照／12h黑暗三种不同的光照处理下，培养并记录数据。

1.5 生防菌枯草芽孢杆菌对细极链格孢的作用

本实验选取的枯草芽孢杆菌SNUB1为普通菌株，SNUB16为生防菌株。将枯草芽孢杆菌SNUB1和SNUB16分别接于PDA斜面，28℃培养48h进行活化，将细极链格孢接于PDA平板，28℃培养5 d进行活化。在PDA平板中央接种经活化的直径为5mm的细极链格孢菌丝块，在菌丝块两侧距中心点3cm处划线接种经活化的枯草芽孢杆菌，以只接细极链格孢的平板为对照，接种后于28℃培养，待细极链格孢长满对照平板时，测量枯草芽孢杆菌SNUB1和SNUB16对极链格孢抑制作用的R值（R值＝病原菌向拮抗菌生长的长度／CK菌落半径）［9］，每个处理3次重复，根据R值的大小，确定枯草芽孢杆菌对细极链格孢有无抑菌作用及抑菌作用的强弱。

2 结果与分析

2.1 叶斑病病原菌生物学特性

2.1.1 不同培养基对叶斑病病原菌菌丝生长的影响 实验结果表明，在供试的6种培养基上，细极链格孢菌在PCA培养基上生长速度最快，在Czapek培养基上生长速度最慢；菌落大小依次为PCA＞ PSA＞CA＞PDA＞CMA＞Czapek，虽然细极链格孢菌在CMA培养基上生长速度较快，但形成的菌落极薄；在不同的培养基上色素形成量存在差别，PDA、PSA、CA培养基上色素分泌多，PCA、CMA、Czapek培养基上色素分泌少，见表1。

细极链格孢在供试的6种培养基上产孢量存在差异，在CA培养基上产孢量最大，CMA为一种营养匮乏的培养基，病原菌在此培养基上产孢量最少。

表1 不同培养基上6 d后病原菌菌落大小Tab.1 The colony size of pathogen on different culture medium after 6 days

2.1.2 不同碳源对叶斑病病原菌菌丝生长的影响

从表2可以看出，细极链格孢菌在6种不同碳源的培养基上都可以生长，说明细极链格孢可利用多种碳源。病原菌在以麦芽糖为碳源的培养基上生长最快，虽然可以在无碳培养基上生长，但形成的菌丝极少，不能覆盖培养基；细极链格孢菌在不同碳源培养基上分泌的色素不同，在含葡萄糖和蔗糖的培养基上，分泌的色素为土黄色，在含可溶性淀粉和乳糖的培养基上，分泌的色素为浅橄榄绿色，在含麦芽糖的培养基上，分泌的色素为浅黄色。

细极链格孢在不同含碳培养基上产孢量存在差异，在乳糖为碳源的培养基上产孢量最大，在缺碳培养基上，产孢量最少。除缺碳培养基外，病原菌在葡萄糖培养基上产孢量最少，说明葡萄糖不利于病原菌产孢。

表2 不同碳源培养基上叶斑病病原菌6 d后菌落大小Tab.2 The colony size of pathogen on culture medium with different carbon source after 6 days

2.1.3 不同氮源对叶斑病病原菌菌丝生长的影响

不同氮源对细极链格孢菌的生长影响较大，他们之间差异显著，见表3。病原菌可在缺氮培养基上生长，且生长速度较快，但菌丝稀少，菌落呈棉絮状，在其他含氮培养基上形成的菌落虽小，但菌落密实。硫酸铵和氯化铵不利于病原菌的生长；细极链格孢菌在不同含氮培养基上产生的色素存在差异，在缺氮培养基上分泌浅橄榄绿色色素，在苯丙氨酸培养基上分泌少量橄榄绿色色素，其他含氮培养基上分泌浅黄色色素。

不同氮源对病原菌产孢影响很大，以氨基酸为氮源的培养基产孢较多，甘氨酸的产孢量最大。在缺氮培养基也可产生孢子，但是铵态氮不利于病原菌产孢。

表3 不同氮源培养基上叶斑病病原菌6 d后菌落大小Tab.3 The colony size of pathogen on culture mediumwith different nitrogen source after 6 days

2.1.4 不同pH值对叶斑病病原菌菌丝生长的影响 从表4可以看出，细极链格孢菌在pH值为3～12的培养基上均可生长，在pH值为4～11的培养基上均能较好地生长。不同pH值培养基上病原菌的生长速率存在差异，pH值为6时，菌落生长速度最快，pH值为3时，菌落生长最慢；pH值影响色素的形成，在低pH值培养基中，随着pH值的降低，色素形成量减少，在高pH值的培养基中，色素形成变化较小。pH值为7时，病原菌产孢量最大。

表4 不同pH值培养基上叶斑病病原菌6 d后菌落大小Tab.4 The colony size of pathogen on culture medium with different pH after 6 days

2.1.5 不同温度对对叶斑病病原菌菌丝生长的影响 从表5可知，不同温度对细极链格孢菌的生长速率存在显著差异。细极链格孢菌在5～35℃内均可生长，在30℃时生长速度最快。细极链格孢菌可以在低温下生长，但是对高温的忍耐力不强，当温度上升到35℃时，该菌的生长速度骤减，40℃时停止生长。

细极链格孢菌在不同的温度条件下产孢量存在差异，在30℃时产孢量最大，40℃和5℃条件下，停止产孢。

表5 不同温度条件下叶斑病病原菌6 d后菌落大小Tab.5 The colony size of pathogen on culture medium in different temperature after 6 days

2.1.6 不同光照条件对叶斑病病原菌菌丝生长的影响 病原菌在12h光照／12h黑暗的条件下生长最快。与12h光照／12h黑暗相比，24h黑暗和24 h光照对病原菌的生长表现出抑制作用，见表6；24 h黑暗培养的病原菌色素分泌减少，而24h光照和12h光照／12h黑暗培养的病原菌色素分泌较24h黑暗的病原菌多。

比较三种光照条件的产孢量，发现24h光照条件下，病原菌产孢量最大，12h光照／12h黑暗和24 h黑暗条件下，病原菌产孢量低，这说明在实验室培养环境中光照有助于病原菌产孢子。

表6 不同光照条件下叶斑病病原菌6 d后菌落大小Tab.6 The colony size of pathogen on culture medium in different light condition after 6 days

2.2 枯草芽孢杆菌对病原菌的抑制

由表7可知SNUB16和SNUB1对病原菌的抑制能力存在显著差异，SNUB16对病原菌的抑制力强，SNUB1对病原菌的抑制力弱。由图1可知SNUB16的生长力极强，表现出较强的生存竞争力，而SNUB1生长力弱。因此，SNUB16有可能作为一种生防菌剂被开发。

图1 枯草芽孢杆菌对叶斑病病原菌的影响Fig.1 The effect of Bacillus subtilis on A.tenuissima

表7 枯草芽孢杆菌对病原菌间抑菌作用Fig.7 The antibacterial distance between B.subtilis and pathogen

3 讨论

细极链格孢菌能在较大的pH范围内生长，Yakoby等［10］的研究表明病原菌自身能调节寄主植物的pH值，因此推测细极链格孢菌菌丝生长过程中产生的物质可能改变培养液的pH值，从而有利于其生长。细极链格孢菌对偏酸的环境较偏碱的环境更敏感。

细极链格孢菌的生长温度范围宽，较适合温度为25～30℃，30℃的环境中产孢量最大，这与桑维钧一［11］和袁蒲英［12］对不同细极链格孢研究结果相似。这一温度与本实验室前期调查发现叶斑病发生于4月，并在5月到6月病情快速发展相吻合，因此，可以推测室外温度对三叶木通叶斑病的影响，可能主要影响细极链格孢菌的菌丝生长和孢子萌发。

细极链格孢菌可以广泛利用碳、氮源，但氯化铵和硫酸铵对细极链格孢菌菌丝生长具有抑制作用，完全抑制孢子的产生，这一结论与前人对链格孢属病原菌的相关研究相一致［13－16］。这些试验结果可用于三叶木通叶斑病病害的防治，如应用硫酸氨、氯化氨等作为增效剂来提高化学药剂对三叶木通叶斑病的防治效果。

枯草芽孢杆菌被认为是一类安全的生防菌，既可以产生多种多肽类抗菌物质，也可以竞争或诱导植物抗性［7］。枯草芽孢杆菌的生防机制主要包括竞争作用、拮抗作用、溶菌作用和促进植物生长等几个方面［17］。本研究中SNUB16较SNUB1生长快，且枯草芽孢杆菌对细极链格孢菌的拮抗区距离小，说明该枯草芽孢杆菌对细极链格孢菌的作用方式可能为竞争。为了提出三叶木通叶斑病的综合防治措施，仍需继续对其进行室外研究。

4 结论

本文从培养基种类、碳源、氮源、pH、温度和光照等方面对三叶木通叶斑病病原菌细极链格孢（Alternaria tenuissima）的生物学特性进行了研究。细极链格孢菌在PCA培养基，30℃，pH值为6，12 h光照／12h黑暗的条件下生长较快；分生孢子在CA培养基，30℃，pH值为7，24h光照的条件下产孢量最大；该病原菌可利用多种碳源和氮源，菌丝的生长会受到硫酸铵和氯化铵的抑制。枯草芽孢杆菌SNUB16可显著拮抗细极链格孢菌的生长。

参考文献：

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〔责任编辑 王 勇〕

Biological characteristics and biological control of leaf spot disease pathogen on Akebiatrifoliata

ZHANG Zheng，LI Xiuqing，LIU Yufeng
（School of Life Sciences，Co－Innovation Center for Qinba Regions′Sustainable Development，Shaanxi Normal University，Xi′an 710119，Shaanxi，China）

The biological characteristics of Akebia trifoliata（Thunb.）Koidz leaf spot pathogen were studied from medium，carbon source，nitrogen source，pH，temperature and light，and its biological controls were discussed briefly.The results showed that the optinal conditions for mycelial growth were PCA medium at 30℃，pH＝6，and alternating 12hlight and 12hdark.The rate of spore germination was the highest at CA medium at 30℃，pH＝7and 24hlight.This pathogenic can use variety of carbon sources and nitrogen sources，and the ammonium sulfate and ammonium chloride can inhibit the growth of pathogen hyphae.（Bacillus subtilis）SNUB16can antagonize Alternaria tenuissima growth.

Akebia trifoliate；leaf spot pathogen；biological characteristic；biological control

Q37

：A

1672－4291（2015）05－0061－06

10.15983／j.cnki.jsnu.2015.04.353

2014－12－31

陕西省科技攻关项目（2010K17－05）

张铮，女，副教授，主要从事植物遗传学方面的研究。E－mail：zhangzheng＠snnu.edu.cn