中介蝮蛇毒L－氨基酸氧化酶基因的生物信息学分析

张 翠，郭积芳，孙 悦，王芳霞，杨章民

（陕西师范大学生命科学学院，陕西西安710119）

中介蝮蛇毒L－氨基酸氧化酶基因的生物信息学分析

张 翠，郭积芳，孙 悦，王芳霞，杨章民＊

（陕西师范大学生命科学学院，陕西西安710119）

采用生物信息学方法，对中介蝮蛇毒L－氨基酸氧化酶（GI－LAO）基因进行了分析。结果表明：GI－LAO基因所包含的开放阅读框为1 515bp，编码504个氨基酸残基；GI－LAO一级结构与白眉蝮GH－LAO的相似性最高，达99%；N－端的18个氨基酸残基为信号肽，成熟肽含486个氨基酸残基，相对分子质量为55.1kDa，理论等电点为6.55；该蛋白含有两个结构域：FAD结合域（56－123位氨基酸残基）和催化结构域（61～499位氨基酸残基）；与白眉蝮GH－LAO序列比对发现，有4个氨基酸位点存在差异（分别是20、56、99和467位氨基酸残基），用SIFT软件分析表明，这四个位点对其功能无影响；该基因编码的氨基酸序列有2个活性位点（H242和R343），2个N－糖基化位点（N190和N379），5个位点（R108、H241、Y390、G482和W483）与底物结合有关，4个保守半胱氨酸残基形成两对二硫键（C28—C191和C349—C430）；三维结构建模结果表明，GI－LAO形成同源二聚体，每个单体由22个α－螺旋，22个β－折叠股和一些无规则卷曲、转角等形成三个结构域：FAD结合域，底物结合域以及α－螺旋域；在GI－LAO蛋白的进化分析中，中介蝮GI－LAO与白眉蝮GHLAO的亲缘关系最近。

中介蝮；L－氨基酸氧化酶；基因；生物信息学

L－氨基酸氧化酶（L－amino Acid Oxidase，LAO，EC1.4.3.2）是一种以黄素为辅酶的酶，能立体异构性氧化L－氨基酸脱氨，生成对应的α－酮酸、氨和H2O2，并伴随氧气的消耗［1］。LAOs广泛存在于蝰科（蝰亚科和蝮亚科）、响尾蛇科、眼镜蛇科、甚至海蛇的毒液中［2］，因其存在而导致新鲜蛇毒呈现黄绿色。蛇毒L－氨基酸氧化酶（Snake venom L－amino acid oxidase，SV－LAOs）是蛇毒中最受关注的家族之一，由于易于纯化而成为研究L－氨基酸氧化酶的酶学、结构生物学和药物学的有趣客体［3］。关于LAOs的报道已经很多，近年来有关研究指出从蛇毒中分离的LAOs具有调控血小板聚集、刺激水肿形成、诱导出血或溶血、抗病毒／HIV活性、抗菌消炎、诱导细胞凋亡和抗寄生虫活性等功能［4］。而且SV－LAOs对血小板聚集的影响呈现相反的作用：Naumann等［5］从巴伊亚盾头蝮（Bothrops leucurus）中分离出的LAO能抑制由ADP诱导的血小板的聚集；而Izidoro等［6］从巴伊亚矛头蝮（Bothrops pirajai）中分离出的LAO却具有诱导血小板聚集的作用。有研究表明SV－LAOs的这些生物活性大部分与其催化产生的H2O2有直接或间接的关系，但也并不完全单独由H2O2引起。这些生物活性使SV－LAOs具有潜在巨大的药用开发价值和临床应用前景，因而受到科研工作者的青睐。

早在1944年，Zeller和Maritiz［1］在毒蝰（Vipera aspis）的毒液中检测到了LAO；1950年，Singer和Kearney［7］首次从美洲食鱼蝮（Agkistrodon pisciuorus Piscivorus）蛇毒中纯化了LAO；随后Wellner和Meister［8］从东部菱斑响尾蛇（Crotalus adamanteus）毒液中纯化并获得了LAO的晶体结构。对于SV－LAOs的研究，20世纪70年代前主要集中在酶学和生理生化特性方面，80年代和90年代主要集中在分离纯化和鉴定方面，90年代以后主要是对其生物活性、结构、克隆表达等方面的研究［9］。

中介蝮为蝰科（Viperidae）蝮亚科（Crotalinae）亚洲蝮属（Gloydius）毒蛇，在国内广泛分布于从蒙新区西部沙漠亚区、天山亚区到西部黄土高原亚区的辽阔区域（国外分布于西伯利亚南部及蒙古共和国），是该地区毒蛇的优势种，也是我国6种蝮蛇中毒性最强的一种［10］。迄今，尚未见关于中介蝮SVLAO的报道。本文采用生物信息学的方法，对来自中介蝮毒腺cDNA文库［11］的一个高丰度表达的SV－LAO基因进行了生物信息学分析，为其生物学活性及应用研究奠定基础。

1 材料与方法

用于分析的中介蝮LAO的cDNA序列来自中介蝮毒腺cDNA文库，生物信息学分析的有关序列均下载自NCBI（National Center for Biotechnology Information）核酸及蛋白质数据库。所选的序列包括：白眉蝮（Gloydius halys，Q6STF1.1）、黄绿原矛头蝮（Protobothrops flavoviridis，BAN82013.1）、竹叶青（Trimeresurus stejnegeri，Q6WP39.1）、诺维特矛头蝮（Bothrops pauloensis，B5AR80.1）、南美巨蝮（Lachesis muta，AFP89360.1）、北美侏响尾蛇（Sistrurus catenatus edwardsi，B0VXW0.1）、非洲锯鳞蝰（Echis ocellatus，B5U6Y8.1）和银环蛇（Bungarus multicinctus，A8QL51.1）。

根据生物信息学软件进行在线分析（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／；http：／／cn.expasy. org／；http：／／www.cbs.dtu.dk／；http：／／psort. nibb.ac.jp／）。用DNAstar进行开放阅读框（Open Reading Frame，ORF）的查找和翻译；用BlastX在线完成cDNA序列的相似性分析；用在线工具SignalP 4.1Server、ProtParam完成信号肽和氨基酸序列的理化性质分析，用NCBI CDD、ClustalX2、SIFT、PROSITE、SWISS－MODEL进行结构域、氨基酸序列比对、氨基酸的忍受度和功能、N－糖基化位点、三级结构的预测；用MEGA5.1绘制进化树。

2 结果与讨论

2.1 中介蝮SV－LAO基因序列

利用DNAstar软件分析该基因的cDNA序列，结果表明该cDNA序列全长1 734bp，包含一个1 515bp的ORF，编码504个氨基酸残基（图1），将该基因命名为GI－LAO，GeneBank登录号为KJ705002。

图1 中介蝮蛇毒GI－LAO的cDNA序列及编码的氨基酸序列Fig.1 The cDNA sequence and deduced amino acids of GI－LAO fromGloydius intermedius

将中介蝮GI－LAO的cDNA序列做BlastX分析，显示GI－LAO与白眉蝮、黄绿原矛头蝮、竹叶青、诺维特矛头蝮、南美巨蝮、北美侏响尾蛇、非洲锯鳞蝰、银环蛇的SV－LAOs编码的氨基酸序列一致性分别为99%、91%、92%、91%、91%、88%、83%、78%。从中可以看出，GI－LAO编码的氨基酸序列与白眉蝮GH－LAO序列相似性最高（99%），与其他几种SV－LAOs序列相似性也很高，显示不同种属蛇毒SV－LAOs基因编码的蛋白在一级结构上高度保守。

2.2 信号肽及理化性质预测

采用SignalP 4.1Server预测中介蝮GI－LAO氨基酸序列的信号肽。结果表明：中介蝮GI－LAO编码的氨基酸序列具有信号肽，可能的酶切位点在18位和19位氨基酸残基之间。因此，GI－LAO编码的氨基酸序列的信号肽为18个氨基酸残基，从第1位氨基酸残基开始到第18位氨基酸残基；成熟肽为486个氨基酸残基，从第19位氨基酸残基开始到第504位氨基酸残基。

根据http：／／cn.expasy.org／网站提供的蛋白质分析软件ProtParam，对GI－LAO编码的成熟肽进行理化性质的预测，结果表明该成熟肽的分子质量为55.1kDa，理论等电点为6.55，属于稳定型蛋白。

2.3 功能结构域和氨基酸位点的预测与分析

采用NCBI CDD分析GI－LAO编码的氨基酸序列的功能结构域。结果表明：GI－LAO包含两个结构域，分别是56～123位氨基酸残基对应的FAD结合域（属于NAD－binding－8结构域）和61～499位氨基酸残基对应的催化结构域（图2），该蛋白属于短链脱氢酶／还原酶（Short－chain dehydrogenases／reductases，SDR）超家族。

图2 中介蝮蛇毒GI－LAO编码的氨基酸序列的功能结构域分析Fig.2 Structure domain analysis of GI－LAO fromGloydius intermedius

由于GI－LAO与白眉蝮GH－LAO氨基酸序列相似性高达99%，因此用ClustalX2软件对GILAO与白眉蝮GH－LAO编码的氨基酸序列进行了比对，差异的氨基酸位点如表1。比较发现中介蝮GI－LAO与白眉蝮GH－LAO有4个氨基酸位点存在差异：其中第20位氨基酸残基在白眉蝮是N，在中介蝮是侧链带负电荷的D；99位氨基酸残基在白眉蝮是侧链带负电荷的D，而在中介蝮是侧链不带电荷的最小氨基酸G，另外2个位点（56位和467位）的氨基酸都属于性质相同的含分支侧链氨基酸，不会对该酶的理化性质产生影响。用SIFT软件预测GI－LAO和GH－LAO中这4个氨基酸差异位点的忍受度和功能，结果表明：这4个位点的差异均不会对GI－LAO的功能产生影响。这也提示我们在后续进行GI－LAO的生物活性检测时，可以参考白眉蝮GH－LAO的检测方法。研究表明，活性位点H223和R322对LAOs介导的催化反应是非常重要的［12］。对于本文研究的GI－LAO，这两个位点分别是H242和R343（因为含有信号肽），在进行序列比对时，也发现这两个位点是保守的。N－连接糖链对于LAOs与细胞表面的相互作用是非常重要的，它能够使相互作用区域的H2O2集中，导致细胞毒性［12］。采用PROSITE预测GI－LAO氨基酸序列的N－糖基化位点，结果表明该氨基酸序列具有两个潜在的N－糖基化位点（Asn－X－Thr／Ser，X为除脯氨酸外的任意氨基酸），分别是N190和N379；预测其底物结合位点分别为：R108、H241、Y390、G482、W483；保守半胱氨酸残基有4个，能形成两对二硫键（C28－C191和C349－C430）。

表1 中介蝮与白眉蝮SV－LAOs氨基酸序列的差异位点比较Tab.1 Comparison of the different amino acid residues between GI－LAO and GH－LAO

2.4 三级结构的预测及分析

图3 中介蝮蛇毒GI－LAO三级结构图Fig.3 3－D deduced structure of GI－LAO fromGloydius intermedius

采用SWISS－MODEL在线同源建模方法，对中介蝮蛇毒GI－LAO编码的氨基酸序列进行建模。以1reoA为模板，所建模型是从第21位氨基酸残基到第504位氨基酸残基。结果（图3）表明该蛋白是由非共价键形成的同源二聚体，每个单体由22个大小不等的α－螺旋，22条β－折叠股和一些无规则卷曲、转角等形成。该蛋白每个单体含有一个FAD辅因子，形成三个结构域：FAD结合域，底物结合域以及α－螺旋域。在底物结合域和α－螺旋域之间形成一个漏斗形底物进入通道，底物进入通道后与活性位点相结合［13］。从所建的模型中也能看出这三种结构域。

2.5 GI－LAO蛋白进化分析

用MEGA 5.1软件中的MP法对GI－LAO蛋白进行进化分析，进化树各分支的置信度由Bootstrap 1000次检验，并且以银环蛇LAO氨基酸序列为外群。结果见图4，可以看出进化树主要分为两大支：银环蛇、北美侏响尾蛇、南美巨蝮和诺维特矛头蝮的SV－LAOs聚为一支；中介蝮GI－LAO与白眉蝮、竹叶青、黄绿原矛头蝮、非洲锯鳞蝰的SVLAOs聚为一支。在蝰科中，GI－LAO与蝮亚科的白眉蝮GH－LAO亲缘关系最近，序列相似性达到99%，揭示出这两种SV－LAOs的功能也非常相似。

图4 用MP法计算的GI－LAO与其他氨基酸序列的进化树Fig.4 Phylogenetic tree by MP method on GI－LAO and other amino acid sequences of snakes

3 结论

蛇毒是自然界最丰富的蛋白源之一，LAO约占蛇毒总蛋白的1%～9%，尤其是在蝰科、响尾蛇科和眼镜蛇科中含量最为丰富［13］。SV－LAOs通常是FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸）或FMN（黄素单核苷酸）结合的糖蛋白同源二聚体分子，通过催化氧化L－氨基酸产生 H2O2，与蛇毒活性和毒性密切相关［4］。通常SV－LAOs保存在4℃中性的缓冲液中，大多数SV－LAOs呈现热不稳定性，其活性与pH和缓冲液离子强度有关。目前已知的LAOs在细胞内一般由两个非共价结合的亚基组成，有些由两个分子质量相同的同源亚基组成，而有些则由两个异源亚基组成。该酶等电点pI变化也很广，从4.0～8.5（酸性、中性和碱性）均有分布，并且以酸性为主。作为一种多功能酶，近年来人们又尝试将SVLAOs作为治疗心血管疾病、细菌性疾病、肿瘤、寄生虫、病毒感染的新型药物。随着对该酶研究的深入，相信在不久的将来，它们作为药物将会在临床上发挥巨大的作用。

本文对中介蝮GI－LAO基因所做的生物信息学分析，有望为后续的生物活性及应用研究打下基础，至于其糖基化类型及程度，对氨基酸底物的选择性，催化活力大小及抗病毒能力，则有待进一步的实验证实。

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〔责任编辑 王 勇〕

Bioinformatics analysis of SV－LAO gene fromGloydius intermedius

ZHANG Cui，GUO Jifang，SUN Yue，WANG Fangxia，YANG Zhangmin＊
（School of Life Sciences，Shaanxi Normal University，Xi′an 710119，Shaanxi，China）

A snake venom L－amino acid oxidase（SV－LAO）gene fromGloydius intermedius cDNA library was bioinformatically analyzed.The results showed that the open reading frame of cDNA is 1 515bp，encoding 504amino acids.The primary structures of LAOs between Gloydius halys and Gloydius intermedius showed the highest identity（99%）.The N－terminal 18amino acids is the signal peptide，so the mature peptide contains 486amino acids，with the theoretical molecular weight and isoelectric point being 55.1kDa and 6.55，respectively.GI－LAO contains two domains，ie.FAD binding domain and catalytic domain.A comparison of the primary structures between GI－LAO with GH－LAO（LAO of Gloydius halys）revealed that there are four amino acids differences（20，56，99and 467）.Online analysis with SIFT software indicated that these differences have no influence on the function of GI－LAO.The key residues in the active site are H242 and R343.The potential N－glycosylation sites are N190and N379.Five residues（R108，H241，Y390，G482，W483）form the substrate binding sites.The four conserved Cys residuces are presumably to form two disulfide bonds（C28—C191and C349—C430）.Tertiary structure remodel－ling revealed that GI－LAO is composed of 22ɑ－helixes，22β－strands，turns and loops，which may then refold into three domains（the FAD－binding domain，the substrate－binding domain and theαhelical domain）.The GI－LAO protein phylogenetic tree indicates a closest relationship between Gloydius halys and Gloydius intermedius.These bioinformatical analysis would lay the foundation for further investigation of GI－LAO as anti－viral agent.

Gloydius intermedius；L－amino acid oxidase；gene；bioinformatics

Q811.4；Q71

：A

1672－4291（2015）05－0071－05

10.15983／j.cnki.jsnu.2015.05.355

2015－02－16

国家自然科学基金（30870303）；中央高校基本科研业务费专项资金（GK200902029）；国家大学生创新训练计划

（CX14067）

张翠，女，硕士研究生，主要研究方向为应用微生物学。E－mail：zhangcui＠snnu.edu.cn

＊通信作者：杨章民，男，副教授，博士。E－mail：yzhangmin＠snnu.edu.cn