DS1226对人乳腺癌细胞ZR-75-30细胞增殖、凋亡和运动的影响*

李娟，王琼，郭侃，甘淋

（四川医科大学医学基础研究中心，四川泸州646000）

DS1226对人乳腺癌细胞ZR-75-30细胞增殖、凋亡和运动的影响*

李娟，王琼，郭侃，甘淋

（四川医科大学医学基础研究中心，四川泸州646000）

目的：检测人参复合物制剂DS1226对人乳腺癌细胞细胞ZR-75-30细胞增殖、凋亡和运动的影响。方法：体外培养人乳腺癌细胞ZR-75-30，予DS1226干预组为DS1226组（实验组），无药物组为对照组。CCK8检测DS1226对ZR-75-30细胞增殖的影响，流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期的改变，进一步用细胞划痕实验检测划痕愈合率。结果：与对照组相比较，CCK8结果显示DS1226时间依赖性抑制人乳腺癌细胞ZR-75-30的细胞增殖，24 h、48 h和72 h的细胞增殖抑制率分别是3.01±0.12%，13.10±0.51%和23.66±4.85%（P＜0.01）；FACS结果显示DS1226干预组的凋亡率从干扰前3.20±0.14%增强至药物刺激后的7.17±0.32%（P＜0.05）；划痕实验显示DS1226干预组24 h与对照组相比划痕愈合明显下降（P＜0.01）。结论：人参复合物制剂DS1226能显著抑制人乳腺癌细胞ZR-75-30的细胞增殖、增强细胞凋亡和降低细胞运动能力。

DS1226;乳腺癌；增殖；凋亡；运动

乳腺癌（Breast Cancer）是女性最常见的恶性肿瘤，其致死率居女性肿瘤死亡率第二位。近年来其发病率与死亡率不断升高，2008年全球确诊肿瘤中23%为乳腺癌，肿瘤死亡病例中约14%为乳腺癌[1]。但是乳腺癌的发病机制不明，目前仍缺乏高效敏感的早期诊断分子标志物和治疗方法，且特效的乳腺癌治疗药品也有待进一步的研究。

人参是一种得到临床认可的，在国内外都得到广泛应用的一种中药，目前越来越多的应用于造血系统、心血管系统、神经系统疾病和化疗辅助治疗等方面，但是在肿瘤治疗方面的研究尚有待进一步深入[2-3]。本研究所采用的药物DS-1226是由人参干燥茎叶抽提的总皂苷水解而成，包括原人参二醇（aPPD）、原人参三醇（aPPT）、人参皂苷Rh2和PAM120等多种成分[4]。

本实验从细胞水平出发，采用CCK-8、流式细胞术、划痕实验等常用分子生物学方法研究人参制剂DS-1226对人乳腺癌细胞增殖、凋亡、运动能力的影响，进而解析人参皂甙DS-1226成为乳腺癌治疗药物的可能性。

1 材料与方法

1.1 材料

人肝癌细胞系ZR-75-30由四川医科大学医学基础研究中心保存；DMEM培养基和胎牛血清均购自美国Gibco BRL公司；Cell Counting Kit-8试剂盒购自日本同仁化学研究所；膜连蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素凋亡试剂盒购自美国BD公司。其余试剂均为化学分析纯。酶标仪为美国Thermo公司产品；流式细胞检测仪为美国的BD公司；细胞划痕实验结果用Image Pro软件分析。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及药物干预：

人乳腺癌细胞ZR-75-30贴壁生长于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，置37℃、5%CO2的细胞培养箱内传代培养；以加入终浓度为5 μg/mL DS1226的细胞为DS1226组，以不加入DS1226的细胞为对照组。DS1226均是实验前即时配制。

1.2.2 细胞增殖实验

将3.0×103个ZR-75-30细胞/孔传代于无菌96孔培养板中。须单独设置空白孔（仅有培养基）、对照孔和实验孔（皆铺有细胞的培养基）。每组设四个平行孔。次日用DS1226作用实验组细胞，同等体积PBS作用细胞组为对照组，置37℃、5%CO2培养箱培养。培养24 h、48 h和72 h后，每孔加入Cell Counting Kit-8溶液10 μL；37℃培养箱中继续温育1 h。用酶标仪读取各孔在450 nm的吸光度，以各时间点的吸光度绘制生长曲线。

1.2.3 细胞凋亡（AnnexinV+PI）的流式细胞仪检测

ZR-75-30细胞按每孔4.5×105个细胞数接种于6孔培养板中，设对照组和DS1226实验组（DS1226作用24 h），次日收集每孔中的细胞和培养液后PBS漂洗2次。依次加入AnnexinV凋亡染色试剂盒中的结合缓冲液20 μL、AnnexinV和PI工作液各5 μL，室温避光染色15 min后上机检测。

1.2.4 细胞周期的检测

ZR-75-30细胞按每孔4.5×105个细胞数接种于6孔培养板中，设对照组和DS1226实验组（DS1226作用24 h）。收集细胞用预冷的70%酒精固定30 min。用PBS洗涤1次后加入RNase A(工作浓度20 μg/ mL，37℃孵育30 min。PBS洗涤后加入PI(工作浓度50 μg/mL)，避光孵育30 min。流式细胞仪上机检测。

1.2.5 划痕实验

ZR-75-30细胞按每孔4.5×105个细胞数接种于6孔培养板中，形成单层贴壁细胞，设对照组和DS1226实验组（DS1226作用24 h）。当细胞铺满孔板，用10 μL移液器枪头在单层细胞上划痕，孵育24 h后去除培养基，PBS洗涤2次后光学显微镜下拍照观察。每组实验重复3次。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 DS1226对ZR-75-30细胞增殖的影响

Cell Counting Kit-8细胞增殖实验结果显示，5.0 μg/mL DS-1226作用ZR-75-30人乳腺癌细胞24 h、48 h和72 h后，DS1226组的细胞增值较对照组均明显下降，差异均有统计学意义（P＜0.01），（图1）。DS1226组的细胞生长抑制率在作用24 h、48 h和72 h分别为3.01%±0.12%，13.10%±0.51%和23.66%±4.85%，DS1226组的细胞生长抑制率随着时间推移逐渐增加（P＜0.01，图1）。

图1 DS1226对人乳腺癌细胞ZR-75-30细胞增殖的作用

2.2 DS1226诱导ZR-75-30细胞凋亡

联合Annexin V和PI的方法检测DS1226对乳腺癌细胞ZR-75-30的细胞凋亡变化。流式细胞仪分析结果如图2所示，与对照组比较，DS1226实验组的凋亡明显增加，细胞凋亡从药物干扰前的3.20%±0.14%上调至干扰后的7.17%±0.32%（P＜0.05）。

图2 流式细胞仪检测细胞凋亡

2.3 DS1226不影响ZR-75-30细胞的细胞周期

流式细胞术检测DS1226作用ZR-75-30后细胞周期的变化。实验发现经DS1226处理之后，人乳腺癌细胞ZR-75-30细胞周期（G1期47.71%± 1.65%，S期32.81%±1.02%）与对照组（G1期45.71%±2.17%，S期34.65%±1.49%）没有明显改变（P=0.078）。

2.4DS1226抑制ZR-75-30细胞运动

划痕实验结果显示，5.0 μg/mL DS1226作用人乳腺癌细胞ZR-75-30 24 h后，DS1226组的细胞运动能力较对照组下降，细胞划痕愈合能力下降（图3）。

图3 对照组与DS1226组划痕实验结果（x 200）

3 讨论

流行病学调查发现乳腺癌高发于经济发达国家，比如美国、欧洲、日本等，如2011年美国乳腺癌新增病例为230,480例，死亡人数则高达39,520人[1]。近年来的研究提示：乳腺癌在发展中国家的发病率、死亡率正在逐渐增高，在中国的一些大城市乳腺癌已经逐渐成为威胁妇女生命的重要杀手[5]。故而能早期诊断、治疗乳腺癌非常重要。中药抗肿瘤可以通过多种机制参与肿瘤生长、增殖、凋亡、代谢等过程,减少患者的肿瘤复发转移，延长患者生存期。目前在传统中药材中寻找高效、低毒的抗癌药物已成为国内外研究焦点。

人参作为一味传统的中药材，广泛应用于心血管、造血系统、神经系统疾病和放化疗辅助治疗。至今从人参中已分离鉴定40多种人参皂甙化合物，如Rb1、Rg1、Rg3、Rd等，发挥抗炎症、抗氧化、血管舒张、抗老化、抗肿瘤等多种作用[6-8]。最近五年已有超过1100篇的论文，但是关于人参制剂对肿瘤的预防治疗作用的研究甚少。然而单方的人参皂苷晶体提纯过程复杂，作用单一，价格昂贵，不适合大规模临床使用。故而本实验选择了人参复合物制剂DS1226胶囊进行试验。

我们以高侵袭的的ZR-75-30人乳腺癌细胞为研究对象，检测DS1226对乳腺癌细胞细胞增殖、凋亡、迁徙运动的影响，探讨DS1226作为乳腺癌治疗药物的可能性。我们的研究发现5 μg/mL人参复合物制剂DS1226作用ZR-75-30细胞24 h后，能抑制ZR-75-30细胞增殖，促进细胞凋亡，提示DS1226可能发挥抗乳腺癌发生的作用。这和其他一些研究小组的结果是相似的。Sharma等[9]发现人参根茎提取物治疗皮肤癌时，可以通过降低谷胱甘肽、维生素C、超氧化歧化酶等明显降低肿瘤的发生率，肿瘤的数目和大小。He研究小组在人肺癌、鼻咽癌及结肠癌等多个细胞株中发现，人参提取物能剂量依赖性的抑制肿瘤细胞的增殖，发挥抗肿瘤的作用[10]。Kim也发现在人乳腺癌细胞系MCF-7和MDAMB-435细胞中，人参单方制剂Rg3、Rg5都能通过多种信号通路调控细胞凋亡，其中Rg5促进凋亡的能力更强[11]。这些结果证实人参制剂确实能发挥抗肿瘤生成的作用，为人参制剂的临床应用提供了研究基础。

在此基础上，我们进一步研究发现DS1226抑制ZR-75-30乳腺癌细胞细胞运动，提示DS1226对乳腺癌的进展有一定的抑制作用。Wang等[12]从人参里面提取的多糖，并进一步在大鼠Lewis肺癌的动物模型上检测其抗肿瘤的作用。发现这种多糖物质能显著抑制肺癌的生长，并能抑制肺转移瘤的产生；同时还能增加脾脏和胸腺的重量，促进LPS诱导的脾淋巴细胞增殖，提高脾脏NK细胞的活性，增加白介素2和干扰素的表达，提示抽提的人参多糖物质能激活免疫功能有效抑制肺癌的转移。另有研究发现一种脂溶性的人参抽提物（LSGE）能通过抑制MMP2的表达有效抑制小鼠黑色素瘤细胞B16F10的运动和侵袭，甚至能抑制体内的黑色素瘤细胞的肺转移[13]。这些结果提示人参可能在肿瘤的侵袭转移中发挥治疗效果。

总之，我们的研究发现人参复合物制剂DS1226能显著抑制人乳腺癌细胞ZR-75-30的细胞增殖、增强细胞凋亡和降低细胞运动能力。这为进一步探讨人参的临床推广应用奠定了实验基础和提供了临床指导。

1.DeSantis C,Siegel R,Bandi P,et al.Breast cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2011,61(6):409-418.

2.Lee CH,Kim JH.A review on the medicinal potentials of ginseng and ginsenosides on cardiovascular diseases[J].Ginseng Res,2014,38(3):161-166.

3.Vayghan HJ,Ghadimi SS,Nourazarian AR.Preventive and therapeutic roles of ginseng-focus on colon cancer [J].Asian Pac J Cancer Prev,2014,15(2):585-588.

4.何怡然，马静遥，陈玲玲，等.DS-1226对慢性限制性大鼠的抗抑郁作用[J].中国实验动物学报，2013,21（3）：42-47.

5.Higgins MJ,Baselga J.Targeted therapies for breast cancer [J].Clin Invest,2011,121(10):3797-3803.

6.Paul S,Shin HS,Kang SC.Inhibition of inflammations and macrophage activation by ginsenoside-Reisolated from Korean ginseng(Panax ginseng C.A.Meyer)[J].Food Chem Toxicol,2012,50(5):1354-1361.

7.Yuying Fan,Chengxin Sun,Xiaoge Gao,et al.Neuroprotective effects of ginseng pectin through the activation of ERK/MAPK and Akt survival signaling pathways[J]. Mol Med Report,2012,5(5):1185-1190.

8.Parvins,LeeoR,SathiyarajG,et al.Interrelationship between calmodulin(CaM)and H2O2 in abscisic acid-induced antioxidant defense in the seedlings of Panax ginseng [J].Molecular Biology Reports,2012,39(7):7327-7338.

9.Sharma J,Goyal PK.Chemoprevention of chemical-induced skin cancer by panax ginseng root extract[J].Ginseng Res,2015,39(3):265-273.

10.Cichello SA,Yao Q,Dowell A,et al.Proliferative and Inhibitory Activity of Siberian ginseng(Eleutherococcus senticosus)Extract on Cancer Cell Lines;A-549,XWLC-05, HCT-116,CNE and Beas-2b[J].Asian Pac J Cancer Prev, 2015,16(11):4781-4786.

11.Kim SJ,Kim AK.Anti-breast cancer activity of Fine lack ginseng(Panax ginseng Meyer)and ginsenoside Rg5[J]. Ginseng Res,2015,39(2):125-134.

12.Wang Y,Huang M,Sun R,et al.Extraction,characterization of a Ginseng fruits polysaccharide and its immune modulating activities in rats with Lewis lung carcinoma[J]. Carbohydr Polym,2015（127）:215-221.

13.Yun J,Kim BG,Kang JS,et al.Lipid-soluble ginseng extract inhibits invasion and metastasis of B16F10 melanoma cells[J].Med Food,2015,18(1):102-108.

（2015-08-31收稿）

作者投稿系统http∶//xb.lzmc.edu.cn/

Effects of DS1226 on proliferation,Apoptosis and migration of human breast cancer cell line ZR-75-30

Objective：To study the effect of Ginseng compound DS1226 on proliferation,apoptosis,and migration of human breast cancer cell line ZR-75-30.Methods：Cultured ZR-75-30 cells were treated with DS1226 as trial group and without DS1226 as control group.Cell proliferation was determined by CCK8 assay, cell apoptosis and cell cycle were analyzed by FACS,and cell migration was evaluated by scratch assay.Results: Compared to control group,DS1226 significantly decreased the proliferation of ZR-75-30 cells in a timedependent manner(P＜0.01),induced cell apoptosis(P＜0.05),and reduced the rate of wound closure(P＜0.01). Conclusion:DS1226 inhibits cell proliferation and migration,and enhances cell apoptosis in human breast cancer cell line,ZR-75-30.

DS1226;Breast cancer;Proliferation;Apoptosis;Migration

R737.9

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2015.06.002

*国家自然基金项目（No:81341121）；四川省科技厅—泸州市—泸州医学院联合课题（14JC155）；泸州市科技局课题（2012-S-36（3/14）

李娟(1978-)，女，副教授，硕士。

甘淋(1978-)，女，副教授，博士。E-mail：gl-gump@163.com

Li Juan,Wang Qiong,Guo Kan,Gan Lin

The Research Center for Preclinical Medicine,Sichuan Medical University，Luzhou 646000,Sichuan Province,China