金创抗菌膏对糖尿病难愈性皮肤溃疡的疗效观察及VIM表达的影响*

殷菱，任晓军，唐莉，刘珉甬，程基焱

(1四川医科大学医学基础研究中心，2四川医科大学附属医院医学实验中心，3四川医科大学护理研究室，四川泸州646000)

金创抗菌膏对糖尿病难愈性皮肤溃疡的疗效观察及VIM表达的影响*

殷菱1，任晓军1，唐莉2，刘珉甬3，程基焱1

(1四川医科大学医学基础研究中心，2四川医科大学附属医院医学实验中心，3四川医科大学护理研究室，四川泸州646000)

目的：探讨金创抗菌膏对糖尿病难愈性皮肤溃疡的疗效及其可能的分子机制。方法：48只健康雄性SD大鼠，适应性饲养一周后，随机分为生理盐水组、表皮生长因子组、金创抗菌膏治疗组（分别16只）。糖尿病模型造模成功后，三组大鼠同时制作皮肤溃疡模型，造模成功后，每天每组分别换药，于第7、14 d，分别处死8只老鼠。观察创面愈合情况及使用HE染色观察压疮皮肤形态结构改变；免疫组织化学技术检测波形蛋白（Vimentin，VIM）的表达。结果：①溃疡愈合情况及HE染色显示，金创抗菌膏组较生理盐水组、表皮生长因子组溃疡恢复快，胶原排列整齐，炎症反应少；②免疫组化第7、14 d的结果显示，与生理盐水组、表皮生长因子组比较，金创抗菌膏组VIM表达最弱，差异具统计学意义（P＜0.05）。结论：金创抗菌膏能促进大鼠糖尿病皮肤溃疡的愈合，其作用优于表皮生长因子，其机制可能是通过控制炎症反应、调节波形蛋白的表达进而影响胶原蛋白的合成。

金创抗菌膏；糖尿病；难愈性溃疡；波形蛋白

糖尿病溃疡是糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）临床常见并发症之一，属于难愈性溃疡，迄今仍是需攻克的医学难题。因此，探索有效治疗DM难愈性皮肤溃疡的方法具有极大的临床意义。在前期的动物实验及临床试用中，我们发现金创抗菌膏对不同皮肤难愈性溃疡的治疗具有良好的效果[1-2]，并显示出炎症反应小，创口愈合快，疤痕组织少等优良特性，但其作用机理尚不明确。金创抗菌膏是否对DM难愈性皮肤溃疡同样也有良好治疗作用还不得而知，为观察金创抗菌膏对DM难愈性皮肤溃疡的疗效，特设计了本实验，同时对其发挥作用的可能机制做初步探讨。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

健康雄性SD大鼠48只，二级、清洁，体重220～260 g（重庆腾鑫生物技术有限公司提供）。

1.1.2 主要试剂

链脲佐菌素：上海信然生物科技有限公司。

金创抗菌膏：泸州天泰生物科技开发有限公司提供。

兔抗鼠VIM单克隆抗体、即用型SABC免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 动物模型的建立

大鼠48只，随机分为金创抗菌膏组（实验组），表皮生长因子组（对照组），生理盐水组（空白组），每组16只。

1.2.1 糖尿病大鼠模型

经普通饲料适应性喂养1周后，大鼠在空腹3 h状态下，称重。以枸橼酸钠缓冲液(浓度：0.1 mmol/ L，pH∶4.6)溶解链脲佐菌素(STZ)，配成1%溶液，按照35 mg/kg尾静脉注射1%链脲佐菌素(STZ)，1周后剪尾取血，检测血糖，随机血糖超过11.1 mmol/L，继续喂养4个月。3组实验动物自由饮水进食。记录各组大鼠进食量及水量进出情况，4个月后，称其体重并剪尾采血检测血糖，造模大鼠随机血糖大于11.1 mmol/L则视为糖尿病大鼠模型成功。

1.2.2 皮肤溃疡模型

三组大鼠以2%戊巴比妥钠腹腔麻醉后，背部用8%硫化钠脱毛。常规消毒，于大鼠背部脊柱附近腰背部两侧，标记出2.0 cm的圆形图案，用手术剪沿着标记范围剪去全层皮肤和皮下结缔组织，避开较大血管，深至筋膜，造成缺损创面。止血后以无菌纱布包扎固定。3组动物均自由饮水与进食。每日用50%冰醋酸涂抹创面一次，1周后形成皮肤溃疡大鼠模型。

从造模成功次日起，每天分组换药，金创抗菌膏组用金创抗菌膏换药，生理盐水组用生理盐水冲洗后包扎处理，表皮生长因子组使用表皮生长因子凝胶处理溃疡创面。各组换药后均在创面上加盖一层薄膜，用医用胶带固定。在造模后第7、14 d各处死一半大鼠，取材，并进行相关实验。

1.3 检测指标及方法

1.3.1 疗效观察

用硫酸铜板纸每天绘制创面大小，计算创面面积及创面愈合率；用相机记录创面变化(颜色、干湿度、肉芽组织生长状态、有无瘢痕)；记录创面愈合时间（创面完全上皮化作为愈合依据）。

1.3.2 形态学检测

标本以4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片。①常规HE染色；②免疫组化染色：采用SABC法。切片脱蜡脱水→3%H2O2阻断内源性过氧化物酶10 min→0.02 mol/L柠檬酸微波修复5 min→滴加非免疫性动物血清封闭非特异性抗原10 min→滴加VIM一抗(1∶100稀释)4℃孵育过夜→滴加二抗(1∶200稀释)37℃孵育20 min→滴加标记过氧化酶的链霉亲和素37℃孵育30 min→DAB(棕色)显色，镜下观察、自来水终止显色。显微镜下观察、照相、分析。

1.4 结果观察、图像分析

根据盲法原则，采用日本OLYMPUS公司的BX-53显微成像系统进行观察分析及照相。每只大鼠取2张切片，每张切片自表皮向真皮深沉按系统抽样法随机抽取8个视野照相。利用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统，测定VIM表达的平均光密度值（Average optical density；AOD）。

1.5 统计分析

2 结果

2.1 溃疡愈合效果观察。

7 d时可见，生理盐水组溃疡愈合一般情况最差，伤口边缘可见明显瘢痕组织生长，凸起，基底部颜色暗红，几乎看不到肉芽组织，渗出明显。金创抗菌膏组溃疡愈合一般情况较其它两组好，伤口直径均匀缩小，周边无瘢痕生成，溃疡基底面红润，有光泽，可见肉芽组织生长，渗出较少。而表皮生长因子组溃疡愈合一般情况比生理盐水组好但比金创抗菌膏组差，溃疡基底部稍暗红，伤口周边可见少量肉芽组织及渗出。

14 d时，金创抗菌膏组，伤口几乎愈合，无渗出，无红肿，与正常皮肤无明显差异。表皮生长因子组溃疡愈合情况不及金创抗菌膏组，有少许瘢痕突起，与正常皮肤略有差异。生理盐水组愈合情况最差，瘢痕组织明显，突起于正常皮肤。7、14 d时测溃疡面积，结果具统计学意义（P＜0.05）。根据公式溃疡愈合速率=（始建溃疡面积-测定时溃疡面积）/始建溃疡面积×100%计算7、14 d时创面愈合百分比，结果显示金创抗菌膏组愈合速率最快，表皮生长因子组次之，生理盐水组最慢（图1、表1）。

图1 糖尿病大鼠皮肤溃疡7、14 d时愈合效果观察

表1 糖尿病大鼠皮肤溃疡7、14 d时溃疡面积（±s，n=8，cm2）

表1 糖尿病大鼠皮肤溃疡7、14 d时溃疡面积（±s，n=8，cm2）

注：与生理盐水组比：a.P＜0.05,与表皮生长因子组比：b.P＜0.05

分组7 d14 d金创抗菌膏组1.2756±0.0708ab0.0423±0.0051ab表皮生长因子组1.5843±0.0776a0.1268±0.0066a生理盐水组2.0895±0.12510.3675±0.0112

2.2 HE染色结果。

7 d时可见：生理盐水组真皮层底部成纤维细胞较少，胶原纤维排列紊乱，有大量炎性细胞聚集；表皮生长因子组溃疡底部真皮层成纤维细胞较多，呈梭形，胶原纤维较细，排列没有金创抗菌膏组整齐，网状结构不明显，有较多炎性细胞聚集；金创抗菌膏组溃疡底部真皮层成纤维细胞数量增多，呈长梭形，细胞体积增大，胶原纤维较细且排列整齐，呈松散疏松的网状结构，真皮层炎性细胞较少。14 d时可见：金创抗菌膏组，成纤维细胞数量减少，胶原整齐，再生复层扁平上皮细胞排列整齐，炎性细胞较少；生理盐水组，成纤维细胞大量聚集，胶原排列紊乱，再生上皮细胞不明显，较多炎性细胞；表皮生长因子组的表现介于其余二组之间（图2）。

图2 溃疡组织7、14 d时HE染色（×400）

2.3 免疫组织化学染色结果。

VIM在溃疡组织中的表达强于周围正常组织，由溃疡表面真皮乳头层至深层阳性表达逐渐减弱；同时在真皮层成纤维细胞胞质中表达，细胞外基质中基本无表达，阳性细胞胞质呈现棕黄色。7、14 d时，金创抗菌膏组表达最弱，空白组表达最强，差异有统计学意义（P＜0.05）；14 d时阳性率高于7 d时，差异有统计学意义（P＜0.05），（图3、表2）。

图3 溃疡组织7、14 d时VIM免疫组化染色（×400）

表2 7、14 d时VIM表达的平均光密度值比较（±s，n=8）

表2 7、14 d时VIM表达的平均光密度值比较（±s，n=8）

注：与生理盐水组比：a.P＜0.05；与表皮生长因子组比：b.P＜0.05，与7 d时比：c.P＜0.05

组别7 d14 d生理盐水组0.325±00.00710.3412±0.0116c表皮生长因子组0.3132±0.0089a0.3243±0.0083ac金创抗菌膏组0.3020±0.0098ab0.3029±0.0100ab

3 讨论

全球流行病学调查显示，25%的糖尿病患者一生中伴随着皮肤溃疡，特别是在末梢血运不足的下肢[3]，5%～15%的皮肤溃疡患者又面临截肢问题；与非糖尿病患者相比，同样的足部感染，糖尿病患者的治疗时间大大延长。金创抗菌膏是一种纯中药制剂[2]，在清热解毒消肿，活血化瘀止痛，去腐生肌敛疮等方面具优良特性。通过本实验观察，在治疗糖尿病难愈性溃疡时，不管是和以往报道对溃疡有治疗作用的表皮生长因子相比较[4-6]，还是和空白对照生理盐水组相比较，金创抗菌膏在促进肉芽组织生长，加速创面愈合，控制炎症反应等方面均表现出更优良的特性，同时创面上皮重建更良好。

波形蛋白（Vimentin，VIM）是间质细胞的标志物，在皮肤创伤后ECM重构中具有非常重要的作用。VIM作为中间纤维的主要成分，与微丝、微管构成了成纤维细胞的网状骨架系统，在维持成纤维细胞形态和功能方面具显著作用。在正常皮肤组织中，VIM表达于表皮的基底层和真皮层中的成纤维细胞中，因此，VIM可用于成纤维细胞增殖数量和活跃程度的鉴定[7]。而在病理性增生的创伤性瘢痕中，VIM的表达量增加[8]，真皮层明显增厚，胶原纤维排列呈团块状，胶原束紊乱，因此有人提出VIM与瘢痕增生相关。Gharbi等[9]发现，前列腺素A1(PGA1)作为创伤的重要炎性介质，可与波形蛋白以共价方式结合于第328个氨基酸残基，并减轻炎症反应，从而减少成纤维细胞的增殖和胶原分泌，达到减少瘢痕的目的。本次实验中，与另外两组相比，金创抗菌膏组在7、14 d时VIM表达最弱，胶原排列整齐，炎症反应少，成纤维细胞增殖最少，溃疡恢复的最快；同时与7 d时相比，在14 d时，生理盐水组和表皮因子组VIM均不同程度升高，并具统计学意义，而金创抗菌膏组VIM表达略微升高，而无统计学意义。可推测金创抗菌膏具有抑制VIM表达，调控胶原纤维排列，控制炎症反应，减少成纤维细胞的增殖和胶原分泌，抑制溃疡愈合过程中瘢痕增生的作用，从而促进糖尿病皮肤溃疡的愈合。

创面的愈合是一个多因素参与的综合过程，受各种因素的调控，而金创抗菌膏的使用，为糖尿病难愈性皮肤溃疡提供了一种有效的临床治疗方案，同时为我国传统中药的发展提供了更多的研发空间，只是其具体治疗机制还需要进一步深入研究。

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2.殷菱，阳艾玲，王勇，等.金创抗菌膏对大鼠压疮皮肤CTGF表达的影响及疗效观察[J].现代预防医学，2013，40(21): 4024-4027，4034.

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4.邹普功，李长明.重组人表皮生长因子凝胶联合复方多粘菌素B软膏外敷对深Ⅱ度烫伤患者创面愈合的影响[J].北方药学，2015，12(3):67.

5.方万芬.重组人表皮生长因子促进Ⅱ度烧伤创面愈合的临床观察[J].中国处方药，2014，12(8):25-26.

6.雷雨.小剂量局部胰岛素联合应用重组人表皮生长因子对烧伤大鼠创面MIP-2和MCP-1表达的影响[J].中国现代医学杂志，2015，25(6):28-33.

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（2015-09-18收稿）

Jinchuang antiseptic ointment promotes wound healing of recalcitrant diabetic ulcer through inhibition of vimentin in rat

Yin Ling1,Ren Xiaojun1,Tang Li2,Liu Minyong3,Cheng Jiyan11Research Center for Preclinical Medicine of Sichuan Medical University，2Experimental Center of Affiliated Hospital of Sichuan Medical University，3Nurse Research Center of Affiliated Hospital of Sichuan Medical University，Luzhou 646000,Sichuan province,China

Objective：To investigate the therapeutic effects of Jinchuang antiseptic ointment to diabetic pressure ulcers and to explore its potential molecular mechanism.Methods：Fourty-eight male model rats of diabetic ulcer were randomly divided into 3 groups(16 per group)∶epidermal growth factor group,physiological saline group,and Jinchuang antiseptic ointment treatment group respectively.The changes of morphological structure were examined by HE staining,and the expression of vimentin were determined by immunohistochemical staining.Results:①Compared with the physiological saline and the epidermal growth factor groups,Jinchuang antiseptic ointment significantly increased the rate of wound healing of ulcers（P＜0.05).②The expression of vimentin was inhibited remarkably in Jinchuang antiseptic ointment group compared to the other two groups（P＜0.05）.Conclusion：Jinchuang antiseptic ointment promotes wound healing of recalcitrant diabetic ulcer in rat model.

Jinchuang of antiseptic ointment;Diabetic ulcer;Vimentin

R242

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2015.06.003

四川省卫生厅科研项目（编号：130267），泸州市科技局科研项目（泸市科【2012】177号）

殷菱（1979-），女，讲师，硕士。

程基焱（1971-），男，教授，硕士。E-mail:49046804@qq.com