二甲丸对大鼠增生型子宫内膜雌、孕激素受体及bcl-2、bax表达的影响

闫 颖，吴林玲，李 军，哈 虹

(天津中医药大学第一附属医院，天津300381)

二甲丸为天津哈氏妇科流派工作室第4代传人张吉金教授在总结哈荔田教授治疗崩漏经验的基础上，结合自己多年的临床实践，根据补虚与驱邪兼顾的益肾软坚散结治疗大法创制而成;该方制成院内制剂，主要治疗功能失调性子宫出血之子宫内膜增生，在临床应用二十余年，疗效显著。本研究通过观察二甲丸对子宫内膜增生大鼠子宫内膜雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)以及抑凋亡基因bcl－2和促凋亡基因bax表达的影响，探讨二甲丸治疗子宫内膜增生的机制，为进一步继承、挖掘名老中医的经验及药物的临床应用提供可靠的理论和实验依据。

1 实验资料

1.1 实验动物 选用健康雌性SPF级SD大鼠80只，体质量200～250 g。

1.2 实验试剂、仪器及设备 二甲丸由仙灵脾15 g、菟丝子15 g、山萸肉 15 g、枸杞子 15 g、熟地 15 g、穿山甲 6 g、莪术 15 g、皂角刺10 g、海藻12g、昆布12g组成，天津中医药大学第一附属医院药剂室制备、补佳乐(Bayer Vital GmbH，批号:H20120369)、地屈 孕酮 (Abbott Biologicals B.V.，批号:20311H01);ER、PR、bcl－2、bax试剂盒均由 santa cruz提供;二抗免疫组化染色试剂盒、DAb显色试剂盒(中杉)。日本奥林巴斯显微镜(bX51T－PHD－J11)，多功能真彩色细胞图像分析管理系统(美国 Media CybERnetics公司 Image－PRo Plus)，石蜡切片机(德国莱卡RM2015)。

1.3 实验方法

1.3.1 分组及造模 将实验大鼠随机分为空白组、模型组、中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组、西药组，其中模型组和西药组14只，其余每组13只。空白组常规饲养;其余组均行去势术，术后第3天起给予补佳乐0.003 mg研末灌胃，每日1次，共40次。造模结束后每组随机选定2只动物处死，取子宫组织进行HE染色，证实是否造模成功[1－2]。

1.3.2 给药干预 造模成功2d后，空白组及模型组均给予5 mL/kg蒸馏水灌胃，中药高剂量组按照二甲丸常用量的2倍、中剂量组按常用量、低剂量组按照常用量的0.5倍灌胃，分别为0.06 g、0.03 g、0.015 g;西药组给予地屈孕酮0.067 mg研磨灌胃，以人的标准体质量60 kg换算成200～250 g体质量大鼠的每日用药量，每天1次，连续14 d。各组动物均自由饮水、进食。

1.3.3 指标测定 模型组造模成功后处死6只留取标本(其余喂养至与其他给药组结束同时处死)，其余各组大鼠均于末次给药后禁食12h，称体质量，颈椎脱臼处死，摘取子宫，标本置入10%多聚甲醛中固定，常规石蜡包埋，石蜡切片经脱蜡水化后，按试剂说明进行S－P法免疫组化染色后用梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，置于镜下观测。每只动物标本切片取4张，每张切片随机连续观察5个高倍镜视野，ER、PR、bcl－2和bax蛋白阳性染色为细胞质内出现棕黄色颗粒沉着，应用多功能真彩色细胞图像分析管理系统(美国Media CybERnetics公司Image－PRo Plus)计算阳性细胞的扫描面积的百分比。

1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行数据处理，各指标间两两比较采用独立样本t检验;ER、PR与bcl－2和bax的相关性采用Pearson线性相关分析。

2 结果

2.1 动物死亡情况 西药组死亡2只，空白组及中药高中低剂量组各死亡1只。

2.2 各组ER、PR、bax、bcl－2表达情况 模型组ER及bcl－2表达水平均明显高于空白组(P均＜0.05)，PR及bax表达水平均明显低于空白组(P均＜0.05);各给药组ER及bcl－2表达水平均明显低于模型组，PR及bax表达水平均明显高于模型组，且中药高剂量组改善最明显，差异均有统计学意义(P均 ＜0.05)。见表1。

表1 各组ER、PR、bax、bcl－2表达情况比较(±s，%)

表1 各组ER、PR、bax、bcl－2表达情况比较(±s，%)

注:①与空白组比较，P＜0.05;②与模型组比较，P＜0.05;③与中药高剂量组比较，P ＜0.05。

组别 n ER PR bax bcl－2空白组 1012.60±5.48134.00±7.16533.80±7.05211.40±4.742模型组 633.50±6.950① 15.50±6.535① 16.33±2.579① 36.67±7.285①中药低剂量组 1031.60±7.662②③ 22.30±9.945②③ 27.60±7.863②③ 25.10±8.608②③中药中剂量组 1029.90±9.339②③ 27.20±6.529②③ 31.00±7.601②③ 31.00±7.601②③中药高剂量组 1024.90±9.550② 29.60±5.522② 29.40±5.602② 27.90±7.128②西药组 1025.70±9.764②③ 27.10±5.801②③ 25.50±5.740②③ 27.90±5.579②

2.3 相关性分析 相关性分析显示，bax表达与ER表达呈负相关，bcl－2与ER表达呈正相关;bax与PR表达呈正相关，bcl－2与PR表达呈负相关。见表2～4。

表2 模型组 ER、PR、bax、bcl－2相关分析

表3 干预后 ER、PR、bax、bcl－2相关分析

表4 治疗前后ER、PR、bax、bcl－2相关分析

3 讨论

子宫内膜增生据其临床表现属于祖国医学“崩漏”范畴，但因子宫内膜异常增厚，符合“癥者，有物可征也”的特点，所以也属于“癥瘕”的范畴。冲任损伤，不能制约经血，胞宫藏泻无度，经血从胞中非时妄行则成崩漏。肾与女子的月经有密切关系，如《素问·上古天真论》所言:“女子七岁，肾气盛，齿更发长;二七而天癸至，任脉通，太冲脉盛，月事以时下，故有子……七七，任脉虚，太冲脉衰少，天癸竭，地道不通，故形坏而无子。”表明肾气盛则天癸至，而任脉充盛，月事以时下。肾藏精，精可化血，血又为月事来潮之物质基础，诚如《女科经纶》引虞氏之说“月水全赖肾水施化”，《傅青主女科》“经水出诸肾”。而崩漏是月经的期、量发生严重紊乱的病证，且崩漏的病情复杂，无论病起何脏，“五脏之伤，穷必及肾”，可见肾气受病是崩漏之根本[3]。现代医家对无排卵性功血的病因病机亦达成了比较统一的认识，认为主要原因是肾虚、血瘀，肾虚型在各类型崩漏中居首位，血瘀见于各型中的不同阶段[4－5]。

张吉金教授认为子宫内膜增生性功能失调性子宫出血多表现为“崩、闭”交替，女子肾气足，冲任通盛，子宫藏泻有常，月经才有周期性、规律性。若肾虚，冲任不足，子宫当藏不藏，当泻不泻，日久瘀滞，但其发病之本为肾虚，标证多为血瘀。基于此而确定补虚与祛邪兼顾的益肾软坚治疗大法。二甲丸即根据该法所立，方中仙灵脾辛、甘、温，补肾壮阳益精气，《本草备要》云其“补命门，益肾气，坚筋骨”。菟丝子辛、甘、平，双补肾阴肾阳，“治男女虚冷，添精益髓”。熟地、枸杞子、山萸肉养血滋阴，添精益髓。五味同用，肾阴肾阳并补，使肾的固藏开合功能正常，冲任气血如期到达胞宫，则经血可按时而下。穿山甲、莪术同具活血通经之功，能去恶血陈凝，攻瘀通络，皂角刺引药入经，可增强上述七味药的作用。方中用鳖甲、半枝莲、海藻、昆布软坚散结，乃遵《内经》通因通用反治之法也，化瘀止血，止血而不留瘀。全方配伍，气血兼顾，升降同用，清化兼施，又寓攻于补，使逐瘀而不伤正，补肾而不留瘀，则冲任得固，气血和平而其病自愈[6]。前期临床研究发现二甲丸可抑制子宫内膜的增生状态[7－9]。

凋亡是分泌期子宫内膜的一个主要特征[10]，提示凋亡可能参与月经的调节。bcl－2是抑制细胞凋亡的原癌基因之一，bax能加速细胞死亡，bax与bcl－2一起调控细胞凋亡。bcl－2基因家族是线粒体凋亡途径中的重要凋亡调节蛋白[11]，分为两类:一类为抗凋亡成员，位于内质网、线粒体膜和核膜等处，包括bcl－2，bcl－xl;另一类为促凋亡成员，正常时存在于胞质或者细胞骨架中，包括bim、bid、bax等。黄凤英等[12]研究指出，整个月经周期腺上皮细胞bax蛋白均有表达，且随着月经周期的进展，其染色强度逐渐增强，分泌期和月经期明显强于增生早期，bcl－2/bax比值也呈明显周期性变化。bcl－2和bax共同表达于增生期子宫内膜腺上皮，且bcl－2明显占优势，可以解释此期缺乏凋亡，内膜得以增殖;分泌早期bcl－2明显减少，bax增加，使这些细胞对凋亡的敏感性增加;而在分泌晚期和月经期，bcl－2缺乏，bax强表达，使内膜细胞不再增殖而发生凋亡，以维持细胞增殖和死亡的动态平衡。可以推想，一旦bcl－2/bax比值失衡，可能会引起子宫内膜萎缩或增殖性疾病形成。本研究结果显示，模型组大鼠的bax表达较空白组明显下降，而bcl－2表达较空白组明显上升，以至于细胞凋亡受到抑制，从而出现子宫内膜过度增殖的状态。

子宫内膜增生究其原因是卵巢无排卵，子宫内膜持续受到单一雌激素的作用，而激素受体是其发挥作用的主要途径。本研究结果显示，药物干预后，bax与ER表达呈负相关，bcl－2与ER表达呈正相关，即随着ER表达的下降，bax表达有上升趋势，而bcl－2表达呈下降趋势;bax与PR表达呈正相关，bcl－2与PR表达呈负相关，即随着PR表达的上升，bax表达有上升趋势，而bcl－2表达呈下降趋势;这种变化与正常大鼠子宫内膜变化相符合。推测益肾软坚法可能通过对ER、PR的介导作用，达到改变bax、bcl－2表达的目的，从而改善子宫内膜增生状态。

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