宫颈癌组织中D2-40标记淋巴管密度与高迁移率族蛋白B1表达的关系研究

刘变利

(西安交通大学第二附属医院，陕西西安710004)

宫颈癌发病率仅次于乳腺癌，是女性常见的恶性肿瘤之一。浸润与转移是宫颈癌难以根治的主要原因，而淋巴结转移是其主要转移途径，在很大程度上决定宫颈癌的预后效果[1]。淋巴管密度(lymphatic vessel density，LVD)是评估肿瘤组织中淋巴管生成的重要指标，对预测评估淋巴管转移风险及预后有重要作用[2]。D2－40单克隆抗体可以与淋巴管内皮细胞发生反应，能够特异性标记淋巴管内皮细胞而排除血管内皮[3]，在淋巴管生成情况的检测中发挥着重要的指示作用。高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein box－1，HMGB1)为一种转录因子，在多种肿瘤组织中高表达，参与肿瘤的增殖、转移、新生血管生成、淋巴管生成等生理活动，阻断HMGB1信号通路可以抑制小鼠移植瘤的浸润和转移[4]。本研究用免疫组化法用D2－40标记LVD，利用Western blot法检测HMGB1表达情况，探讨宫颈癌组织中LVD与HMGB1表达的关系，现将结果报道如下。

1 临床资料

1.1 一般资料 选取2008—2010年于我院就诊的接受手术切除的宫颈癌患者86例，术前均未接受其他肿瘤治疗手段，肿瘤分期及病理类型明确，为原发性癌症，且其他器官无严重病变;患者知情同意，临床资料完善。排除术前接受过药物、放化疗等治疗者，合并其他肿瘤疾病者，临床资料不完整者。年龄25～72(40.13±7.58)岁;FIGO 分期:TNMⅠ +Ⅱ期41例，Ⅲ+Ⅳ期45例;高中分化39例，低分化47例。患者诊断均经病理科2位以上专家确认，手术取样每个样本取2份，每份样品包括正常组织和癌组织，一份用于免疫组化检测，一份用于Western blot检测。

1.2.2 －40检测 所取新鲜组织经4%多聚甲醛固定12～24 h，用乙醇进行梯度脱水后用二甲苯进行透明处理，透明后用石蜡进行包埋。包埋的蜡块切成5 μm厚度的组织切片，用10 mmol/L柠檬酸溶液进行抗原修复，3%H2O2消除内源性过氧化物酶。一抗采用鼠抗人单克隆抗体D2－40(北京中杉金桥生物)，阴性一抗用抗体稀释液代替。所用试剂盒及苏木素购自福建迈新，免疫组化及DAB染色按照试剂盒说明书进行，苏木素染核经二甲苯透明后用中性树脂进行封片。

1.3 HMGB1表达检测 取新鲜组织，用PBS洗掉多余的血液，用ELB裂解液裂解，破碎，12000 r/min 4℃离心20～30 min后，测定蛋白浓度。加入 loading buffer煮沸，经 SDSPAGE电泳，电转，牛奶封闭，孵育一抗和二抗，过程中用TBST洗膜，ECL显影，对Western显色条带进行定量分析。

1.4 结果判定标准

1.4.1 D2－40阳性标准 细胞浆染色呈棕黄色或褐色。在光学显微镜下淋巴管呈闭塞或扩张的条索状，管壁覆盖单层上皮细胞，周围无清晰的平滑肌细胞和基底膜，管内无红细胞。

1.4.2 D2－40标记淋巴管计数[5]首先在低倍视野内(100×)找到癌组织部位高密度的淋巴管区域，再在400×的显微镜下对淋巴管数目进行统计，计数过程中单个着色内皮细胞或内皮细胞团视为一个淋巴管，每个样本选取5个视野，计算后取平均值即为该样本的淋巴管个数。

1.5 统计学方法 用SPSS 18.0软件进行数据分析，计量数据以均数±标准差(±s)表示，采用t检验，LVD与HMGB1表达相关性用Pearson线性相关分析进行，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 D2－40标记的LVD表现 宫颈癌组织中淋巴管壁薄形态不规则，管腔增大，其内无红细胞，肿瘤细胞及血管内皮无着色，淋巴管主要位于周边区间质中，较正常组织增多，癌组织中心无新生淋巴管，见图1。正常宫颈组织中淋巴管形态规则，管壁薄，血管内皮无着色，见图2。

图1 D2－40标记的LVD在宫颈癌组织中的形态(SP 10×20)

图2 D2－40标记的LVD在正常宫颈组织中的形态(SP 10×20)

2.2 宫颈癌组织与正常组织中LVD水平比较 正常组织中LVD水平为4.66 ±1.77，癌组织中LVD水平为8.36 ±2.65，癌组织中LVD水平明显高于正常组织(P＜0.05);Ⅲ+Ⅳ期患者癌组织中LVD水平为10.35±3.73，Ⅰ+Ⅱ期患者癌组织中LVD水平为6.67±3.34;同时Ⅲ+Ⅳ期患者癌组织中LVD水平明显高于Ⅰ+Ⅱ期患者(P＜0.05)。

2.3 宫颈癌组织与正常组织中HMGB1表达情况 正常组织中HMGB1表达水平为1.05±0.19，癌组织中HMGB1表达水平为1.45±0.26，癌组织中HMGB1表达水平明显高于正常组织(P＜0.05);Ⅲ+Ⅳ期患者癌组织中HMGB1表达水平为2.42±0.53，Ⅰ+Ⅱ期患者癌组织中HMGB1表达水平为1.71±0.31，同时Ⅲ +Ⅳ期患者癌组织中 HMGB1表达水平明显高于Ⅰ+Ⅱ期患者(P＜0.05)。Western显色条带定量分析情况见图3。

图3 HMGB1蛋白表达情况

2.4 宫颈癌组织中LVD与HMGB1相关性分析 Pearson相关分析显示，宫颈癌组织中LVD与HMGB1表达水平呈显著正相关(r=0.97，P＜0.05)。见图4。

图4 宫颈癌组织中LVD与HMGB1相关性

3 讨论

淋巴结转移是造成晚期宫颈癌治疗及预后效果差的主要因素，而实体瘤外围的淋巴管道的增多则是淋巴结转移的基础[6]。张江宇等[7]研究表明，肿瘤细胞的浸润会分泌一些淋巴因子来促进周围淋巴管的增生，从而促进肿瘤的生长和远处转移。D2－40是一种单克隆抗体，它可以特异性的标记淋巴管内皮细胞而将淋巴管与血管区分开来。本研究结果表明，宫颈癌组织中LVD水平显著高于正常组织，可能与肿瘤细胞的浸润、转移等相关;Ⅲ+Ⅳ期患者癌组织中的LVD水平显著高于Ⅰ+Ⅱ期患者，提示LVD水平随FIGO分期的发展而增高，且由于Ⅲ+Ⅳ期患者癌细胞浸润、侵袭活动较Ⅰ+Ⅱ期患者的更为频繁，故其会分泌更多促淋巴管生长的因子而促进淋巴管的生长，满足肿瘤细胞的侵袭及远端转移活动。

HMGB1是一种细胞因子，参与缺血性疾病、炎症反应、肿瘤生长和发展等多种病理生理活动。李妍等[8]的研究表明，在宫颈癌细胞中HMGB1的表达水平较高，且LVD随HMGB1表达的增加而升高，HMGB1与LVD表达呈正相关。本研究结果显示，宫颈癌组织中HMGB1表达水平显著高于正常组织，并且Ⅲ+Ⅳ期患者肿瘤组织中的HMBG1表达水平也显著高于Ⅰ+Ⅱ期患者，与吴英娟[9]研究结果相似。此外，邱媛媛[10]在Hela细胞中也证实干扰HMGB1可以影响肿瘤细胞的侵袭、转移活动。结合 Tafani等[11]和孙小云等[12]的研究结果，推测HMGB1在宫颈癌组织中高表达与肿瘤细胞的侵袭、转移密切相关。Pearson相关性分析发现，LVD与HMGB1呈显著正相关，因此可以明确LVD与HMGB1在肿瘤的发生过程中是通过相互协同的作用共同促进肿瘤的发展。

综上所述，宫颈癌组织中LVD与HMGB1的表达呈显著正相关关系，与肿瘤的发展密切相关，二者可能通过相互作用，共同促进肿瘤细胞的侵袭、转移等活动。但二者是通过哪种机制相互协同促进宫颈癌的浸润、侵袭及转移还需要进一步的研究。

[1] 柴红娟，施薇，杜光烨，等.D2－40在宫颈癌淋巴管生成、淋巴管浸润中的临床意义[J].实用医学杂志，2014，3(12):2019－2020

[2] 邓恋.鼻咽癌淋巴管密度及淋巴管侵犯与淋巴结转移的关系[D].桂林:桂林医学院，2013

[3] 周勤，杨顺实，彭彩霞.彩超和D2－40免疫组化检测对甲状腺癌颈淋巴结转移的诊断价值研究[J].中国全科医学，2014，17(11):1253－1256

[4] 吴蔚.LYVE－1、VEGF－C、HMGB1在宫颈鳞癌中的表达及意义[D].银川:宁夏医科大学，2012

[5] 王洪建，杨帆，胡安祥.D2－40标记阳性淋巴管密度检测在老年非小细胞肺癌中的临床价值[J].中华全科医学，2014，12(2):189－191

[6] 王冬颖，吴静，刘变利，等.Ⅰb～Ⅱb期宫颈癌淋巴管生成与HMGB1表达的关系[J].临床与实验病理学杂志，2013，29(11):1247－1249

[7] 张江宇，邓文瑜，陈文静，等.D2－40在宫颈癌发展过程中表达的研究[J].中国妇幼保健，2013，28(12):1963－1965

[8] 李妍，郝权.高迁移率族蛋白1和肿瘤相关巨噬细胞与宫颈癌淋巴管密度的相关性研究[J].中国肿瘤临床，2014，41(4):222－226

[9] 吴英娟.宫颈癌组织中HMBG－1、PCNA的表达变化及临床意义[J].山东医药，2015，55(23):21－23

[10] 邱媛媛.HMGB1与宫颈癌转移的相关性研究[D].天津:天津医科大学，2011

[11] Tafani M，Schito L，Pelleqrini L，et al.Hypoxia-increased RAGE and P2X7R expression regulates tumor cell invasion through phosphorylation of Erk1/2and Akt and nuclear translocation of NF－{kappa}B[J].Carcinogenesis，2011，32(8):1167 －1175

[12] 孙小云，张旭艳，闫雪，等.宫颈癌组织中 HMGB1、Notch1的表达及相关性[J].山东医药，2015，55(10):30－32