新耐药基因HA117在神经母细胞瘤中的表达及临床意义

陈建飞金先庆

新耐药基因HA117在神经母细胞瘤中的表达及临床意义

陈建飞1金先庆2

HA117；基因；神经母细胞瘤；MDR1；免疫组织化学

全反式维甲酸（ATRA）是我国学者首先使用的白血病化疗药物及实体瘤辅助化疗药物[1]。在肯定ATRA对恶性肿瘤的疗效时，ATRA在使用后存在诱导肿瘤多药耐药的现象也同样受到广泛的关注[2-3]。本课题组在建立HL-60/ATRA耐药株的基础上成功筛选并发现一未知的耐药新基因，并命名为HA117（Genebank Number：CB214920）。在前期研究[4]中，我们已成功构建携带HA117基因的重组腺病毒和其沉默质粒，并验证了HA117具有明显的多药耐药功能。在此基础上，我们成功构建HA117多克隆抗体[5]，并检测在结肠癌、肺癌、乳腺癌等组织中有较强的表达[6]。为进一步检测HA117蛋白在儿童实体肿瘤中的表达，初步分析其耐药机制，本研究应用S-P免疫组化法，检测神经母细胞瘤中HA117蛋白的表达情况，分析其临床病理意义，并与MDR1基因做比较，初步分析其耐药机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集重庆医科大学附属儿童医院2009年—2012年神经母细胞瘤标本30例，男18例，女12例，年龄5个月～6岁，平均3.81岁。病理分型：预后良好型（FH型）16例，预后不良型（uFH）10例，其余4例由于标本原因未分型。明确有伴淋巴结及远处转移者11例。每例均由两名重庆医科大学附属儿童医院资深病理科医师做病理诊断。

1.2 试剂及仪器 HA117多克隆抗体（本实验室保存）；MDR1单克隆抗体（南京博士德生物公司，2012090701）；KIT-9921即用型免疫组化（402141211），EliVision TM Super试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司，20120201）。组织包埋机，组织切片机，微波炉，4℃冰箱，显微镜等。

1.3 方 法

1.3.1 免疫组织化学检测方法 所有标本均用10%福尔马林溶液固定，石蜡包埋，厚5μm连续切片，贴附于经多聚赖氨酸处理的切片，之后60℃烤片18h。切片经脱蜡水化，用0.01mol柠檬酸缓冲液（pH6.0）进行微波加热抗原修复，3%双氧水灭活过氧化物酶，BSA封闭抗原，以1：100比例稀释浓缩型第一抗体，滴加40μL一抗后4℃冰箱过夜。PBS冲洗后分别滴加生物素标记的二抗和SP复合物放大效应，DAB显色，镜下控制显色时间并中止反应，苏木素复染，脱水透明、封片。

1.3.2 结果判定 HA117表达呈棕黄色或棕褐色为阳性，每片观察5个40倍光镜下视野，用Image-Pro Plus 6.0软件计算阳性细胞数，根据试剂公司提供的判断标准：阳性细胞数少于10%肿瘤细胞的胞质呈棕黄色为阴性表达（-），10%~25%为低度表达（+），25%~75%为中度表达（++），>75%为高度表达（+++）；中高度表达为强阳性表达，表示肿瘤对该耐药基因所介导的药物具有耐受性；MDR1以相同方法判定。1.4 统计学方法 应用SPSS17.0软件进行统计分析，计数资料采用χ2检验，检验水准P=0.05。

2 结果

2.1 HA117蛋白表达 HA117蛋白主要在细胞胞浆中表达，呈棕黄色或棕褐色表达，阳性表达率70%，瘤旁正常组织的表达率为21%，两者比较差异有统计学意义（P<0.05），见表1、图1～2（封三）。

2.2 HA117蛋白表达与Shimada病理分期的关系按照Shimada病理分期法把神经母细胞瘤分为FH型（Favorable Histology Group）和uFH型（UnfavorableHistology Group）两种[7]。30例神经母细胞瘤中有16例FH型，10例uFH型，其余4例因为标本原因未进行分期。其中FH型中有HA117蛋白表达8例，表达率50%，uFH型10例全部表达，表达率100%，两者比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表1 HA117在神经母细胞瘤及非瘤组织表达情况（例）

表2 HA117在神经母细胞瘤不同病理分型表达情况（例）

2.3 HA117与MDR1蛋白在神经母细胞瘤组织表达 30例神经母细胞瘤组织HA117阳性表达率70%，MDR1表达率为60%，两者比较差异无统计学意义（P>0.05）。HA117主要在细胞胞浆表达，MDR1主要在细胞胞膜表达。见表3，图3～4（封三）。

表3 HA117与MDR1蛋白在神经母细胞瘤表达（例）

3 讨 论

神经母细胞瘤是儿童中最常见的颅外实体瘤，多发生于肾上腺、盆腔和头颈部，预后极差[7]。化疗是神经母细胞瘤综合治疗中的重要方法。但在神经母细胞瘤化疗当中，耐药问题突出，因此也越来越引起重视。有研究[8]表明神经母细胞瘤的耐药机制并非单一机制引起，可能是MDR1、GST-π等多种基因协同作用的结果。有研究表明，神经母细胞瘤中，MDR1、GST-π存在高表达，说明神经母细胞瘤存在耐药性，并且耐药机制可能存在多种机制。

新耐药基因HA117作为近几年新发现的耐药基因，对于肿瘤耐药基因谱是一个补充。HA117基因已经被证明在多种实体肿瘤与非实体肿瘤中存在不同程度的表达，并证明参与肿瘤的多药耐药[9-11]。但在神经母细胞瘤中的表达及耐药机制未被研究。

本研究结果显示，神经母细胞瘤中，HA117的表达明显高于癌旁正常组织，结果差异有统计学意义（P<0.05），说明神经母细胞瘤存在多药耐药。神经母细胞瘤Shimada分型分为FH型和uFH型。有研究表明，MDR1、TopoII、LRP在uFH中表达比FH显著增强，提示uFH型神经母细胞瘤对化疗药物耐药性更为显著，本研究发现，uFH型神经母细胞瘤中HA117表达明显增高FH型，结果有显著差异性。表明uFH型神经母细胞瘤更具有耐药性，可以考虑在化疗前进行ATRA诱导，以取得更好的化疗效果。HA117基因在神经母细胞瘤中的表达与经典耐药基因MDR1无显著差异，但从表达部位看，HA117主要表达在细胞胞浆，MDR1主要存在在细胞胞膜。目前研究表明，MDR1的主要作用机制是通过膜蛋白将细胞内的药物泵出细胞，从而引起肿瘤耐药，HA117主要表达在细胞胞浆，推测作用机制可能是通过细胞内的代谢机制降低胞内的药物浓度，从而引起肿瘤耐药。HA117蛋白的高表达，是相继MDR1、GST-π、TopoII后，对于神经母细胞瘤耐药原因的重要补充。为选择肿瘤敏感药物时，是否选择ATRA进行诱导提供依据。

［1］Huang ME，Ye YC，Chen SR.Use of all-trans retinoic acid in the treatment of acute promyelocytic leukemia［J］.Blood 1988，72：567-572.

［2］Sun R，Liu Y，Li SY，et al.Co-delivery of all-trans-retinoic acid and doxorubicin for cancer therapy with synergistic inhibition of cancer stem cells［J］.Biomaterials，2014，23，37C：405-414.

［3］Chu T，Zhou H，Wang T，etal.In vitro characteristics of Valproic acid and all-trans-retinoic acid and their combined use in promoting neuronal differentiation while suppressing astrocytic differentiation in neural stem cells［J］.Brain Res，2015，30，1596：31-47.

［4］郭玉霞，罗庆，徐酉华.耐药相关新基因HA117的克隆及重组腺病毒制备［J］.重庆医科大学学报，2008，33（6）：641-645.

［5］陈建飞，金先庆，丁雄辉，等.新耐药基因HA117多克隆抗体的制备与鉴定［J］.第三军医大学学报，2011，33（11）：1128-1131.

［6］李昆昆，金先庆.新基因HA117在肠腺癌中的表达及意义［J］.重庆医学，2011，14：1358-1360.

［7］施诚仁，金先庆，李仲智.小儿外科学［M］.第4版.北京：人民卫生出版社，2009：132.

［8］李晓晗，郑华川，吕庆杰，等.MDR1和GST-π在神经母细胞瘤中的表达及临床病理意义［J］.中国医科大学学报，2002，33（1）：56-58.

［9］Duan W，Jin X，Xiu Y，et al.Expression of the novel alltrans retinoic acid-related resistance gene HA117 in pediatric solid tumors［J］.Pediatr Hematol Oncol，2014，36（1）：45-50.

［10］Che Y，Xu YH，Zheng GH，et al.Clinical significance of HA117 expression in children with acute leukemia［J］. Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban，2009，40（5）：873-876.

［11］Zhao LH，Jin XQ，Xu YH，et al.Functional study of the novelmultidrug resistance gene HA117 and its comparison tomultidrug resistance gene 1［J］.Journal of Experimental &Clinical Cancer Research，2010，29（1）：1-7.

（收稿：2015-01-28 修回：2015-05-05）

1浙江省嘉兴市妇幼保健院新生儿重症监护病房（嘉兴314000）；2重庆医科大学附属儿童医院普外科（重庆 410000）

金先庆，Tel：15105731339；