PTEN和FHIT在结直肠癌组织的表达和意义

朱 艳 葛伟林

PTEN和FHIT在结直肠癌组织的表达和意义

朱 艳 葛伟林

目的 研究磷酸酯酶与张力蛋白同源物（PTEN）和脆性三联组氨酸（FHIT）的表达与结直肠癌（CRC）临床病理参数之间的关系。方法 102例CRC组织标本，取53例癌旁组织正常结直肠黏膜做对照，采用免疫组织化学S-P法检测PTEN和FHIT蛋白在CRC组织、正常组织中的表达情况，分析PTEN和FHIT的表达与CRC的相关性。结果 ①PTEN在CRC组织和正常组织中表达的阳性率分别为40.2%（41/102）和84.9%（45/53），两者差异具有统计学意义（P＜0.01）；FHIT在CRC组织和正常组织中表达的阳性率分别为44.1%（45/102）和92.5%（49/53），差异有统计学意义（P＜0.01）；②PTEN和FHIT的表达与性别、年龄、肿瘤大小无显著相关性（P＞0.05），与Dukes分期、分化程度和淋巴结转移相关（P＜0.01），PTEN的表达与肿瘤部位无关，FHIT的表达与肿瘤部位相关（P＜0.05）；③Spearman等级相关分析提示，PTEN和FHIT在CRC组织间的表达呈正相关（r=0.616，P＜0.01）。结论 PTEN和FHIT参与了CRC的发生发展过程，两者联合检测对于评估CRC的生物学特性和判断预后具有一定价值。

结直肠癌；磷酸酯酶与张力蛋白同源物；脆性三联组氨酸

原癌基因的激活与抑癌基因的失活是肿瘤发生过程中重要的分子事件。磷酸酯酶与张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）和脆性三联组氨酸（fragile histidine triad，FHIT）都被认为是重要的抑癌基因，其缺失和突变常导致肿瘤的发生[1-2]。

本研究通过免疫组织化学方法联合检测结直肠癌（colorectal carcinoma，CRC）组织PTEN和FHIT蛋白的表达以及与CRC的临床病理参数之间的关系，分析二者之间表达的相关性，以期为CRC的发生机制提供初步理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料 收集本院外科2007年2月—2013年行结直肠癌根治手术并具有完整临床数据的病理标本102例，并取53例距离肿瘤组织8cm以上的癌旁正常组织为对照，所有患者术前均未接受化疗、靶向治疗和放疗。其中男63例，女39例；年龄34～77岁，平均年龄52.5岁。左半结肠癌22例，横结肠癌9例，右半结肠癌20例，乙状结肠癌17例，直肠癌34例。Dukes分期：A期17例，B期33例，C1期19例，C2期15例，D期18例；组织学分型：高分化15例，中分化24，低分化55例，未分化8例。对照标本经HE染色镜下未见肿瘤细胞。

1.2 试剂和方法 一抗鼠抗人PTEN单克隆抗体和兔抗人FHIT单克隆抗体试剂盒均购自福州迈新公司。二抗及免疫组化试剂盒购自北京中杉生物科技公司。所有标本均以10%福尔马林固定，石蜡包埋，每例蜡块以4μm厚度连续切片，用于免疫组化染色。应用免疫组织化学链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶（SP）法，操作步骤按试剂盒提示进行，切片经处理后进行HE染色和免疫组化染色。PTEN的工作浓度为1:200，FHIT的工作浓度为1:150。用磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作为阴性对照，用已知的PTEN和FHIT阳性的胃癌切片作阳性对照。

1.3 结果判定 由两名病理专家阅片，根据PTEN和FHIT在肿瘤细胞中出现棕黄色或棕褐色染色判定为阳性。PTEN蛋白染色多位于细胞质，癌巢中心染色较强，为棕黄色颗粒状。FHIT蛋白染色多位于细胞质，部分表达于细胞膜，为黄色或棕黄色颗粒状。每张切片随机选取10个高倍镜视野（×400），根据阳性细胞百分率及显色深浅进行分类判断。其中染色强度0：无染色；1：淡黄色；2：棕黄色；3：棕褐色。后按阳性细胞所占百分比记分：＜5%为0分，5%~ 25%为1分，25%~50%为2分，50%~75%为3分，＞75%为4分；根据两项积分之和为每张切片组织染色结果，＞3分记为阳性，≤3分记为阴性。

1.4 统计学方法 应用SPSS17.0软件进行统计分析，计数资料比较采用χ2检验，PTEN和FHIT表达相关性采用spearman相关分析方法，取P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PTEN蛋白在CRC组织和正常组织表达 102例CRC中PTEN蛋白呈阳性表达41例，表达率40.2%；53例正常组织中PTEN蛋白阳性表达45例，表达率84.9%。PTEN在正常组织中表达高于CRC组织，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1

2.2 FHIT蛋白在CRC组织和正常组织表达 102例CRC中FHIT蛋白45例呈阳性表达，表达率44.1%；53例正常组织中阳性表达49例，表达率92.5%。FHIT在正常组织中表达高于CRC组织，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

表1 PTEN和FHIT蛋白在CRC和正常黏膜表达（例）

2.3 PTEN和FHIT蛋白表达与CRC的临床病理参数的关系 PTEN与FHIT的表达与性别、年龄、肿瘤大小无显著相关性（P＞0.05），而Dukes分期较晚、分化程度低和淋巴结转移者，两者表达呈下降趋势，差异有统计学意义（P＜0.01）。结肠癌患者FHIT的表达高于直肠癌患者而PTEN表达与癌灶部位无关。见表2。

表2 PTEN和FHIT蛋白表达与CRC的临床病理参数（例）

2.4 PTEN和FHIT相关性 在102例结直肠癌组织中，PTEN和FHIT表达均为阳性38例，均为阴性54例；PTEN表达阳性而FHIT表达阴性3例；PTEN表达阴性而FHIT表达阳性7例；采用spearman等级相关分析结果显示，PTEN与FHIT蛋白在结直肠癌组织表达呈正相关（r=0.616，P＜0.01）。见表3。

表3 PTEN和FHIT的相关性（例）

3 讨论

结直肠癌的发生是一个多因素、多阶段、多步骤综合作用的结果，其发生发展的分子机制仍未阐明。目前认为，PTEN和FHIT蛋白的表达异常与CRC的发生和发展有关，但PTEN和FHIT与CRC的关系存在争议。

PTEN基因由Li等在1997年首次发现，它定位于10q23.3，全长200kb，转录产物为515kb mRNA，其蛋白产物含有一酪蛋白磷酸酶的功能区和约175个氨基酸左右的与骨架蛋白tenasin、auxilin同源的区域，是迄今发现第一个具有双重磷酸酶活性的抑癌基因[1]。它可能通过阻断酪氨酸蛋白激酶来抑制肿瘤细胞生长，抑制细胞由G1期进入S期，并调节肿瘤细胞的侵袭和转移。PTEN由于基因突变、缺失、甲基化等过程使mRNA和蛋白表达降低，从而导致肿瘤的发生。PTEN在人类消化道肿瘤、肾癌、乳腺癌中均存在表达缺失，被认为与肿瘤的恶性程度呈正相关，其低表达则预示患者预后不良[3-5]。Sawai等[6]通过比较PTEN在伴有和不伴有肝转移的CRC组织表达，发现前者75.4%呈弱表达，在肝转移组织中表达缺失，后者62.9%呈强阳性表达，且发现PTEN阳性表达患者的5年生存率显著高于阴性表达患者。本研究证实，PTEN在CRC中出现特异性表达缺失，这与大多数研究结果相符。进一步发现在Dukes分期C-D期、结肠癌细胞低分化和未分化以及伴有淋巴结转移的患者，PTEN的表达均较病理分期早、细胞分化好、无淋巴结转移的患者低，提示该基因的缺失在诱导肿瘤细胞分化、促进肿瘤细胞浸润和转移方面有着重要作用。

FHIT基因是一种抑癌基因，定位于3p14.2区域，由10个外显子组成，编码的FHIT蛋白由147个氨基酸残基组成，分子量为16 800，表达于人体多种器官如心、肝、肾以及消化道组织中[2]。FHIT的失活已有研究表明，FHIT表达的缺失见于胃癌、食管癌、卵巢癌、膀胱癌和肝癌等组织中，并与肿瘤的发生、侵袭、转移和预后相关。Nan等[7]通过免疫组化和TUNEL法检测了47例原发性肝细胞癌组织中FHIT和PCNA的表达，发现所有正常肝脏组织中均高表达FHIT，而59.6%肝癌组织中表达缺失，且FHIT的表达与病理分期和有无转移密切相关，提示FHIT在肝细胞癌的发生和发展中起重要作用。但也有研究通过FHITmRNA的定量分析后发现，在86%的CRC和60%的腺瘤组织中都检测到高水平表达，与免疫组化结果相吻合；且FHIT蛋白在Dukes’C/D期和N1/N2淋巴结转移的CRC组织中亦呈高表达[8]。本研究发现，FHIT蛋白在正常组织表达高于CRC组织，推测FHIT蛋白可能是结直肠组织正常生长的必要因素之一；通过分析发现FHIT蛋白表达与CRC病理分期和组织分化程度关系密切，且在结肠癌和直肠癌中的表达存在差异，提示FHIT在结肠癌和直肠癌发生发展中可能存在不同的作用机制，有待进一步研究。有学者[9]通过组织微阵列（TMA）和TUNEL方法对CRC中FHIT、Bax、Bcl-2和Survivin基因进行检测，发现FHIT基因突变导致其表达下调，同时伴有抗凋亡基因Bcl-2和Survivin表达的上调和凋亡基因Bax的下调。提示FHIT的突变可能通过以上途径促进正常结直肠黏膜向癌组织的转变。

Zheng等[10]通过含有正常胃黏膜、腺瘤、胃癌组织的组织微阵列检测了PTEN和FHIT的表达，发现PTEN和FHIT双阳性患者预后相对较好，而且在胃癌组织中的表达呈正相关，并提示PTEN和FHIT的下调可能打破了细胞凋亡和增殖平衡，而促进癌变的发生。已有文献对PTEN和FHIT蛋白在结直肠癌组织中表达的相关性研究较少。本研究显示，结直肠癌组织中PTEN和FHIT蛋白的表达呈正相关，两个基因常存在同时失活现象，具体协同机制有待于今后进一步研究。

本研究通过免疫组化方法联合检测PTEN和FHIT在结直肠癌组织和正常结直肠组织中表达的差异，初步证实PTEN和FHIT参与了结直肠癌的发生发展过程。因此，联合检测结直肠癌组织中PTEN和FHIT蛋白的表达可为结直肠癌的侵袭和转移能力提供参考价值，并对判断结直肠癌患者的预后具有重要意义。

［1］Li J，Yen C，Liaw D，et al.PTEN，a putative protein tyrosine phosphatase gene mutated in human brain，breast，andprostate cancer［J］.Science，1997，275（5308）：1943-1947.

［2］Croce CM，Sozzi G，Huebner K.Role of FHIT in human cancer［J］.JClin Oncol，1999，17（5）：1618-1624.

［3］Zou TT，Lei J，Shi YQ，et al.FHIT gene alterations in esophageal cancer and ulcerative colitis（UC）［J］.Oncogene，1997，15（1）：101-105.

［4］ Campiglio M，Pekarsky Y，Menard S，et al.FHIT loss of function in human primary breast cancer correlates with advanced stage of the disease［J］.Cancer Res，1999，59（16）：3866-3869.

［5］袁禧先，张丹，王凤荣，等.基质金属蛋白酶-9与抑癌基因PTEN在大肠腺瘤、大肠癌组织中的表达及意义［J］.世界华人消化杂志，2008，16（10）：1132-1136.

［6］Sawai H，Yasuda A，Ochi N，et al.Loss of PTEN expression is associated with colorectal cancer liver metastasis and poor patient survival［J］.BMCGastroenterol，2008，8：56-62.

［7］Nan KJ，Ruan ZP，Jing Z，etal.Expression of fragile histi dine triad in primary hepatocellular carcinoma and its relation with cell proliferation and apoptosis［J］.World JGastroenterol，2005，11（2）：228-231.

［8］Wierzbicki PM，Adrych K，Kartanowicz D，et al.Fragile histidine triad（FHIT）gene is overexpressed in colorectal cancer［J］.JPhysiol Pharmacol，2009，60（Suppl 4）：63-70.

［9］Cao J，Li W，Xie J，et al.Down-regulation of FHIT inhibits apoptosis of colorectal cancer:mechanism and clinical implication［J］.Surg Oncol，2006，15（4）：223-233.

［10］Zheng H，Takahashi H，Murai Y，et al.Low expression of FHIT and PTEN correlates with malignancy of gastric carcinomas：tissue-array findings［J］.Appl Immunohistochem MolMorphol，2007，15（4）：432-440.

（收稿：2014-09-21 修回：2014-11-07）

Expressions of PTEN and FHIT in Colorectal Carcinoma and Their Clinical Pathological Significance

ZHU Yan,GE Weilin. Department of Surgery,Xiangshan County Hospital of Traditional Chinese Medicine,Xiangshan (315711),China

Objective To investigate the expression of phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten（PTEN）and fragile histidine triad（FHIT）in colorectal cancer（CRC）and their relationship to clinical pathology of colorectal cancer.M ethods One hundred and 2 CRC specimens were collected and 53 specimens of adjacent normal mucosa tissues served as control.PTEN and FHIT expressions in CRC specimens and controls were detected by S-P method and their relationship with CRC was evaluated.Results The positive rate ofPTEN in CRC specimens and controls were 40.2%（41/102）and 84.9%（45/53）,and the expressions of FHIT were 44.1%（45/102）and 92.5%（49/53）,respectively,both with a significant difference（all P<0.01）.Both of PTEN and FHIT were related to Dukes stages and tumor pTNM classification（P<0.01）,but not related to gender,age,and size of the tumor（P>0.05）;PTEN was not related to the location of the tumor but FHIT was（P<0.05）.Spearman rank correlation analysis showed that PTEN was correlated with FHIT in CRC tissues（r=0.616,P<0.01）.Conclusion PTEN and FHIT were involved in the development and progress of CRC.To evaluate the expression of both proteins may be valuable for the study of biological features and prognosis of CRC.

colorectal carcinoma;phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten（PTEN）;fragile histidine triad（FHIT）

浙江省象山县中医院外科（象山 315711）

朱艳，Tel：18268892660；E-mial：zhuyanxs@sina.com