时间分辨荧光免疫法检测脑脊液结核分枝杆菌特异性抗原的诊断价值

马春静,邹薇,王丽.齐齐哈尔建华医院检验科，黑龙江齐齐哈尔　6000；.齐齐哈尔医学院第二附属医院输血科，黑龙江齐齐哈尔　6000；.齐齐哈尔市中医医院检验科，黑龙江齐齐哈尔　6000

时间分辨荧光免疫法检测脑脊液结核分枝杆菌特异性抗原的诊断价值

马春静1,邹薇2,王丽3
1.齐齐哈尔建华医院检验科，黑龙江齐齐哈尔161000；2.齐齐哈尔医学院第二附属医院输血科，黑龙江齐齐哈尔161000；3.齐齐哈尔市中医医院检验科，黑龙江齐齐哈尔161000

[摘要]目的对时间分辨荧光免疫法检测脑脊液结核分枝杆菌特异性抗原的诊断价值进行研究。方法整群选取2012年6月—2013年6月于该院确诊为结核性脑膜炎患者48例，收集患者的脑脊液，建立时间分辨荧光免疫分析法检测脑脊液中ESAT-6-CFP10抗原。同时采用TRIFA法和ELISA法对结核性脑膜炎患者脑脊液检查特异度进行检测。结果ESAT6/CFP10 的TRIFA法稳定性好，线性宽，其检测灵敏度为2.5 ng/mL，平均回收率为97.6%，批内变异系数平均为3.35%，批间CV平均为5.32%。TRFIA法结核性脑膜炎患者脑脊液检查特异度为92.6%，明显高于ELISA法的82.4%，差异有统计学意义（P< 0.05，χ2=5.5311）。结论TRFIA法敏感度、精密度、重复性、线性相关性较好，检测脑脊液中ESAT-6-CFP10抗原对诊断结核性脑膜炎有很高的敏感度和特异度。

[关键词]时间分辨荧光免疫法；检测；脑脊液；结核分枝杆菌；特异性抗原

结核性脑膜炎(TBM)是临床上比较严重的致命性的结核病类型之一，患者患该病时，预后比较差，往往可能会危及生命安全[1]。目前来说，结核性脑膜炎诊断的金标准是在患者的脑脊液中检测到结核分枝杆菌(MTB)的存在。在感染早期，致病型结核分枝杆菌一般会分泌大量的特异性蛋白，即6000-早期分泌性抗原靶（ESAT-6）与抗原培养滤液蛋白10（CFP10），并且这两种蛋白不存在在卡介苗BCG中，故其可以作为活动性结核的标志物。时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）法是以镧系元素为示踪物，代替荧光物质酶同位素化学发光物质，标记抗体抗原激素多肽蛋白质核酸探针及生物细胞，大幅度降低了非特异性结合并提高了灵敏度，其灵敏度高，稳定性和，而且检测限也比较宽[2]，故通过建立检测ESAT6/CFP10融合蛋白的TRFIA方法，探讨其是否能够很好的用于结核性脑膜炎的诊断。

1　资料与方法

1.1一般资料

整群选取2012年6月—2013年6月于该院进行治疗的确诊为结核性脑膜炎患者48例，其中男25例，女23例，年龄22～66岁，平均年龄（43.4±3.5）岁。根据病史、辅助检查、短期抗结核治疗效果临床诊断为结核性脑膜炎。

1.2试剂与仪器

DR6608型TRFIA检测仪由中山大学达安基因股份有限公司提供；Eu3+标记试剂盒及发光增强液购于美国Wallac公司；96孔微孔板购于美国corning公司；结核分枝杆菌ESAT6酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒由上海宝曼生物科技有限公司提供；ESAT6/CFP10融合蛋白及其单克隆抗体（IgG）与多克隆抗体（IgG）由上海博研生物科技有限公司提供[3]。

1.3方法

常规腰椎穿刺抽取患者脑脊液2 mL，每管0.5 mL分装，存放于-20℃待分批测定CFPl0和ESAT-6，所有操作均严格按照操作说明书进行。运用双抗体夹心法，先在微孔内包被一层ESAT-6-CFP10融合蛋白单克隆抗体，然后加入100 uL各浓度的标准品和样品，在常温下振荡孵育1h，洗涤3次，5 min/次，然后加入稀释100倍的Eu3+＋－抗ESAT-6-CFP10融合蛋白多克隆抗体100 uL，常温下振荡孵育1 h，洗涤6次，5 min/次，再加入100 uL增强液，孵育5 min，将其放入时间分辨荧光仪进行荧光检测，进行标准曲线的测绘，然后根据方程进行样品中ESAT-6-CFP10二聚体蛋白的含量的计算[4]。

1.4统计方法

统计学软件为SPSS15.0，计数资料采用χ2检验，检验水准为α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1ESAT6/CFP10融合抗原

TRFIA标准曲线的绘制经过计算，方程为y=1.2274x+ 2.6879，R2=0.9959。而且从图可以得出，ESAT-6-CFP10二聚体蛋白的含量与荧光计数成正比关系。

图1　ESAT6/CFP10抗原的TRFIA标准曲线

2.2回收

试验在浓度为5.4 ng/mL的ESAT6/CFP10的1 mL健康人血清中，分别加入各1 mL浓度为25、200、400 ng/mL的ESAT6/ CFP10标准品，计算样本回收率。回收率分别为96.9%、98.5%、98.3%，平均回收率为97.6%。

2.3精密度

在荧光计数值高、中、低值中随机选取3份ESAT-6-CFP10样品，每天平行测定20孔，计算批内变异系数CV，得出结果分别为4.3%、3.2%、2.6%，平均为3.35%；连续检测20个工作日，计算批间变异系数CV，得出结果分别为5.6%、5.21%、4.9%，平均为5.32%。

2.4灵敏度

选取不同浓度的ESAT6/CFP10融合蛋白2.5、5、10、25、50、100、500 ng/mL进行检测。最后结果为，ELISA法检出最低限为25 ng/mL，TRFIA法检出最低限为2.5 ng/mL。同时选择经检测荧光值较高的1例结核性脑膜炎患者脑脊液标本进行倍比稀释至132 768，用TRFIA法与ELISA法同时进行抗原的检测。ELISA法的最低阳性检出14 096，而TRFIA法在132 768时仍为阳性。

2.5检查结果分析

TRFIA法结核性脑膜炎患者脑脊液检查特异度为92.6%，明显高于ELISA法和结核分枝杆菌涂片或培养法，差异具有统计学意义，χ2值分别为5.5311、13.121，P均＜0.05。TRFIA法与ELISA法和结核分枝杆菌涂片或培养法在敏感度比较方面，三者并差异无统计学意义，χ2值分别为2.1334、2.134，P>0.05。

表1　检查结果分析（%）

3　讨论

近年来，结核的发病率有上升的趋势，其感染源主要为结核分枝杆菌，它是典型的胞内寄生菌，活动期结核性脑膜炎病人脑脊液中的结核杆菌可以被单核巨噬细胞吞噬，巨噬细胞提供了结核杆菌隐藏和繁殖的场所，同时还起到浓缩结核杆菌抗原的作用[5]。分离培养是诊断结核的金标准，但最大的缺点是检测周期太长，严重滞后于临床诊治，也不能确定是否为结核分枝杆菌感染。当机体受到结核杆菌感染后，体内首先会出现结核抗原，可作为机体是否发生了该疾病的感染，而且特异性强。

CFP10和ESAT6是由结核杆菌在早中期分泌释放于菌体外的一组相对分子质量较低的蛋白，都是由结核分枝杆菌RD.1基因编码，主要存在于人型和致病性牛型结核分枝杆菌中，在卡介苗中缺失[6]。因此可作为活动性结核的标志物，在卡介苗菌株和大部分环境中的分枝杆菌基因中则缺乏该序列，不受卡介苗接种干扰，可以避免假阳性，故具有诊断性抗原的优势。另外，ESAT6和CFP10的融合蛋白综合了单一抗原的优势，具有更强大的活化能力，比单一抗原更为敏感，而且并不降低特异性[7]。TRFIA法利用了具有独特荧光特性的镧系元素及其螯合物为示踪物，灵敏度高、特异性强、稳定性好，同时可以定量检测[8]。

该研究将TRFIA方法应用于定量测定ESAT-6-CFP10抗原的含量，结果显示，TRFIA方法检测的灵敏度非常高，最低检出限可以达到2.5 ng/mL，而且其具有较宽的检测范围，特异性较好，TRFIA法结核性脑膜炎患者脑脊液检查特异度为92.6%，明显比常规的ELISA法和结核分枝杆菌涂片或培养法高，表明时间分辨荧光免疫法检测脑脊液结核分枝杆菌特异性抗原对早期诊断具有重要的意义。国内学者李新玲等[9]同样采用时间分辨荧光免疫法对脑脊液结核分枝杆菌特异性抗原进行了检测，其数据也表明TRFIA方法具有较高的敏感度，而且特异性也好，与该研究数据先符合，表明该研究结果具有一定的可靠性。

目前用TRFIA法测ESAT6/CFP10抗原可作为优于其他辅助检查的一项新的检查手段用于临床结核分枝杆菌感染的早期诊断，随着研究的进一步深入，该方法有可能成为简便地诊断结核病的一个金标准；且该方法对检测条件的要求不高，结果可靠，对加强结核病的预防控制有重要意义。

[参考文献]

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[4]郭旻,范学文.结核分枝杆菌早期分泌抗原ESAT-6对结核性脑膜炎诊断价值的研究[J].宁夏医学杂志,2011,33(1)：3-5.

[5]张昆南,文安,杨赟,等.ELISA法检测浓缩脑脊液ESAT-6对结核性脑膜炎的诊断价值[J].中国神经免疫学和神经病学杂志,2014,21(5)：360-363.

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[9]李新玲,黄怀宇,吴俊渊,等.时间分辨荧光免疫法检测脑脊液结核分枝杆菌特异性抗原的诊断价值[J].中华医院感染学杂志,2012,22(18)：4168-4170.

Detection of Specific Antigen of Mycobacterium Tuberculosis in Cerebrospinal Fluid by Time -resolved Fluoroimmunoassay and Its Diagnostic Value

MA Chun-jing1, ZOU Wei2, WANG Li3
1.Department of Clinical Laboratory, QiqiharJianhua Hospital , Qiqihar, Heilongjiang, 161000 China; 2.Department of Blood Transfusion, Second Affiliated Hospital of Qiqhar Medical University, Qiqihar, Heilongjiang, 161000 China; 3.Department of Clinical Laboratory, Qiqihar Hospital of Traditional Chinese Medicine, Qiqihar, Heilongjiang, 161000 China

[Abstract]Objective To investigate the application of the time-resolved fluoroimmunoassay (TRIFA) in detecting the specific antigen of mycobacterium tuberculosis in cerebrospinal fluid and evaluate its diagnostic value. Methods The ESAT6/CFP10 antigen in the cerebrospinal fluid of 48 patients who were confirmed with tuberculous meningitis in our hospital during June 2012 and June 2013 were detected by time-resolved fluoroimmunoassay. For the diagnosis of tuberculous meningitis, the specificity of TRIFA in detecting the specific antigen of mycobacterium tuberculosis and that of the ELISA was compared. Results In detecting ESAT6/CFP10 antigen, TRIFA was stable and wide in linearity range, and its sensitivity, the mean recovery rate, the within-run and interday-run coefficients of variation were 2.5 ng/mL, 97.6%, 3.35%, 5.32%, respectively. The specificity of TRIFA in detecting the specific antigen of mycobacterium tuberculosis was 92.6%, obviously higher that of ELISA, 82.4%, and the difference was statistically significant（P<0.05,χ2=5.5311）. Conclusion With good sensitivity, precision, repeatability and linear correlation, TRFIA applied in the detection of ESAT6/CFP10 antigen in the cerebrospinal fluid has high sensitivity and specificity for the diagnosis of tuberculous meningitis.

[Key words]Time-resolved fluoroimmunoassay; Detection; Cerebrospinal fluid; Mycobacterium tuberculosis; Specific antigen

[中图分类号]R378.9

[文献标识码]A

[文章编号]1674-0742（2015）07（c）－0074-02

[作者简介]马春静（1978.6-），女，辽宁辽中县人，本科，主管检验师，研究方向：检验。

收稿日期：（2015-04-25）