参橘止咳滴丸微生物限度检查法的建立和最大耐受量实验*

李 娟，封士兰，郭朝晖

1甘肃省人民医院，甘肃兰州730000；2兰州大学药学院；3甘肃省食品药品检验所

参橘止咳滴丸微生物限度检查法的建立和最大耐受量实验*

李 娟1，封士兰2，郭朝晖3

1甘肃省人民医院，甘肃兰州730000；2兰州大学药学院；3甘肃省食品药品检验所

目的：建立参橘止咳滴丸微生物限度检查方法，并测定其最大耐受量。方法：测定参橘止咳滴丸对5种验证菌株的回收率，并对控制菌的检查法进行验证；同时，小鼠灌胃给予参橘止咳滴丸120 g/（kg·d）(相当于人临床用量的2 290.08倍)，观察14天，记录有无死亡发生，确定小鼠对参橘止咳滴丸的最大耐受量。结果：回收率试验结果表明，参橘止咳滴丸供试品试验菌的回收率试验均高于70%，证明无抑菌现象；一次性给予高剂量参橘止咳滴丸，经过14天的连续观察，小鼠无死亡且一般状态良好。结论：参橘止咳滴丸可按常规方法进行微生物限度检查，且具有较高的安全性。

参橘止咳滴丸；微生物限度；最大耐受量

参橘止咳滴丸是以甘肃省名中医徐鸿达主任医师的临床经验方为依据，采用现代制剂技术研制的滴丸剂，其处方主要由玄参、陈皮等中药组成，具有清热抗炎，止咳利咽的功效，对外感咳嗽和慢性气管炎急性发作引起的咳嗽疗效确切［1］。本实验根据2010版《中国药典》微生物限度检查法的相关规定，建立参橘止咳滴丸的微生物限度检查方法，进行方法验证，并通过最大耐受量试验来评价其安全性，以期为参橘止咳滴丸开发使用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验药物 参橘止咳滴丸(甘肃陇神戎发制药有限公司提供，批号：20061009、20061209、20070214)。

1.2 实验材料 营养琼脂培养基；玫瑰红钠琼脂培养基；胆盐乳糖增菌培养基；大肠埃希菌［CMCC (B)44 102］，金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26 003］，枯草芽孢杆菌［CMCC(B)63 501］，白色念珠菌［CMCC(F)98 001］，黑曲霉［CMCC(F)98 003］，均由中国药品生物制品检定所提供。

1.3 实验动物 昆明种小白鼠40只，体质量18～22 g，由兰州大学实验动物中心提供［动物实验合格证号：SYXK(甘)2005-0007］。

1.4 实验仪器 超净台 (苏州净化设备公司提供)；电热鼓风干燥箱(天津市实验仪器厂提供)；JT75-2型隔水式培养箱(余姚县恒温箱厂提供)；电热恒温培养箱(南京实验仪器厂提供)。

1.5 方法

1.5.1 最大耐受量实验［2-5］取小鼠40只，雌雄各半，按体质量随机分为给药组和对照组。给药组灌胃给予参橘止咳滴丸120 g/(kg·d)(相当于人临床用量的2 290.08倍)，对照组灌胃给予同体积的生理盐水。于末次给药后观察小鼠14天内体质量变化、饮食、外观、行为、分泌物、排便物、死亡情况及中毒反应。对濒死及死亡动物及时进行解剖，其他动物于观测结束后进行解剖，当发现器官出现体积、颜色、质地等改变时则对改变的器官进行组织病理学检查。

1.5.2 微生物限度检查方法验证实验［6-9］

1.5.2.1 菌液制备 取经30～35℃培养18～24小时的枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的肉汤培养物1mL，取经25℃培养24～48小时的白色念珠菌液体培养物1mL，分别用0.9%无菌氯化钠溶液，10倍逐级地稀释至10-5～10-7，菌数约为50～100 cfu/mL，做菌液组计数，备用。取经25℃培养7天的黑曲霉斜面培养物，加3～5 mL 0.9%无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子，吸取霉菌孢子液1mL加9mL0.9%无菌氯化钠溶液，10倍逐级地稀释为10-4，菌数约为50～100 cfu/mL，备用。

1.5.2.2 供试液制备 称取供试品10g，至pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100mL中，置45℃水浴中使溶解，摇匀，制成1∶10供试液。

1.5.2.3 细菌、霉菌和酵母菌计数方法验证(回收率测定)实验组：取1∶10的供试液各1mL分别注入2个平皿中，加入50～100 cfu实验菌，立即倾注凉至45℃的熔化的相应的琼脂培养基15～20 mL，摇匀，凝固后，将平皿倒置于规定的温度培养至规定的时间，计数。菌液组：取实验菌液各1mL，分别放入2个平皿中，立即倾注凉至45℃的熔化的相应的琼脂培养基15～20 mL，摇匀，凝固后，将平皿倒置于规定的温度培养至规定的时间，测定所加的验证菌数。供试品对照组：取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。

1.5.2.4 控制菌检验方法 取1∶10供试液各10mL，分别加入2瓶各含100mL的胆盐乳糖增菌液中，其中1瓶加10～100 cfu大肠埃细菌，另1瓶加10～100 cfu金黄色葡萄球菌，置于规定温度培养至18～24小时。

1.6 统计学方法 运用SPSS 16.0软件建立数据库，计量资料以(±s)表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 最大耐受量实验 给小鼠单次灌胃给予参橘止咳滴丸120 g/(kg·d)后，小鼠的精神反应、体毛肤色、呼吸步态、摄食饮水、排泄物及其他情况均无异常，未见明显毒性反应及死亡情况。见表1—2。2组相比较，小鼠的体质量都明显增加，差异无统计学意义(P＞0.05)，见表3。14天后解剖小鼠，肉眼及显微镜检查未见脏器有明显病理改变。

表1 参橘止咳滴丸最大耐受量实验小鼠死亡情况

表2 参橘止咳滴丸最大耐受量实验小鼠反应情况

表3 参橘止咳滴丸最大耐受量实验小鼠的体质量变化(±s)g

表3 参橘止咳滴丸最大耐受量实验小鼠的体质量变化(±s)g

注：*表示与对照组比较，P＞0.05。

组别 只数 0天 7天 14天对照组20 19.76±1.29 26.12±1.99 29.95±3.10给药组20 19.87±1.24*25.89±2.21*30.00±3.02*

2.2 微生物限度检查方法验证实验 通过对参橘止咳滴丸进行3次独立的平行实验，发现实验组的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率都远高于70%，符合药典规定，说明参橘止咳滴丸可以采用常规法进行菌数计数方法验证。见表4。通过对参橘止咳滴丸控制菌检查，阴性对照菌组均未检出大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌，说明可以采用常规法对参橘止咳滴丸进行控制菌检验。见表5。

表4 常规法测定各实验菌株的回收率 %

表5 控制菌验证结果

3 讨论

3.1 最大耐受量实验 参橘止咳滴丸处方中的玄参和陈皮均非毒性药材，亦无十八反、十九畏等配伍禁忌，又未经化学处理(水、乙醇粗提除外)，由于预实验无法测出该复方制剂的半数致死量(LD50)，提示该中药复方制剂安全范围很大，所以改做小鼠最大耐受量实验［120 g/(kg·d)，相当于人临床用量的2 290.08倍)。试验发现：小鼠最大量灌胃给药后14天内，其在摄食、饮水、粪便、尿液及精神、四肢活动和体质量方面，与对照组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)，表明参橘止咳滴丸安全范围较大，在正常剂量无毒副作用，服用安全。

3.2 微生物限度检查方法验证试验 本实验依照《中国药典》2010年版建立参橘止咳滴丸的微生物限度检查方法，并对控制菌的进行方法学验证，其验证菌株为5种，其中大肠埃希菌代表革兰氏阴性杆菌、金黄色葡萄球菌代表革兰氏阳性球菌、白色念珠菌代表酵母菌、黑曲菌代表霉菌和枯草芽孢杆菌是代表药品中常见的污染菌-芽孢杆菌。通过实验发现参橘止咳滴丸对实验菌的回收率试验均高70%，控制菌检查具有较好的专属性，因此，其微生物限度检查可按常规法进行。

［1］ 徐静汶，刘小花，赵良功，等.高效液相色谱法同时测定参橘止咳滴丸中肉桂酸、橙皮苷和哈巴俄苷含量［J］.浙江师范大学学报：自然科学版，2009，32(3)：313-314.

［2］ 徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学［M］.3版.北京：人民卫生出版社，2002：886-887.

［3］ 陈奇.中药药理实验方法学［M］.北京：人民卫生出版社，1993：112-119.

［4］ 傅萍，邓娟.血竭加味颗粒的急性毒性实验最大给药量(最大耐受量)的测定［J］.浙江中医药大学学报，2008，32(5)：674-675.

［5］ 叶华，曾茂贵，罗戢彬凯，等.蓝花参抗炎、止痛的药效学与急性毒性试验研究［J］.西部中医药，2012，25(5)：49-51.

［6］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部［M］.北京：中国医药科技出版社，2010：附录ⅩⅢ.

［7］ 李晓东，李娟，郭朝晖，等.几种医院外用中药制剂微生物限度检查方法的建立［J］.西部中医药，2012，25(2)：25-27.

［8］ 章红星，金建平.消炎利胆滴丸微生物限度检查方法的建立［J］.北方药学，2011，8(3)：9-10.

［9］ 代心平，谌乐刚.清开灵滴丸微生物限度检查的方法学验证［J］.海南医学，2008，19(12)：87-88.

Study on the Establishm entofM icrobial Lim itand M TD Test for ShenJu ZhiKe D ripping Pills

LIJuan1,FENG Shilan2,GUO Zhaohui3
1 People′s Hospital of Gansu Province,Lanzhou 730000,China; 2 Pharmacy School of Lanzhou University; 3 Gansu Institute for Food and Drug Control

Objective:To establishmicrobial lim it testand measure themaximum-tolerated dose(MTD)of ShenJu ZhiKe dripping pills.Methods:The recovery ratesof5 verified strains treated by ShenJu ZhiKe dripping pills were detected by routinemethod,and them icrobial lim it testmethod for the controlbacteriawas validated;Meanwhile,ratswere observed continuously for14 daysafterbeing given ShenJu ZhiKe dripping pills120 g/(kg·d)by intragastric administration(equivalent to 2290.08 timesof the clinicaldosage),then the dead ratswere recorded and their MTD could be obtained.Results:The recovery rates of ShenJu ZheKe dripping pills for the verified strains were higher than 70%,which indicated no antim icrobialeffectof the pills;in the experimentofMTD,after rats being given ShenJu ZhiKe dripping pills of high dose one time,no rats died for 14-day observation and they were in perfectly good condition.Conclusion:M icrobial limit tests for ShenJu ZheKe dripping pills can be conducted w ith conventionalmethod and thehigher safety can beensured.

Shenju Zhike dripping pills；m icrobial limit test；MTD

R259

A

1004-6852(2015)02-0018-03

2014-08-27

兰州市科技计划项目(编号05-1-48)。

李娟(1981—)，女，主治医师。研究方向：慢性病的康复治疗。