黑逍遥散对阿尔茨海默病模型大鼠行为学及血清肿瘤坏死因子α及白细胞介素-6和-1β的影响*

杨长生，吴红彦，李海龙，容倩倩

甘肃中医学院，甘肃兰州730000

黑逍遥散对阿尔茨海默病模型大鼠行为学及血清肿瘤坏死因子α及白细胞介素-6和-1β的影响*

杨长生，吴红彦△，李海龙，容倩倩

甘肃中医学院，甘肃兰州730000

目的：观察黑逍遥散对β-淀粉样蛋白（Aβ25-35）所致阿尔茨海默病（Alzheimer disease,AD）模型大鼠血清肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素（IL-6、IL-1β）表达的影响，探讨黑逍遥散防治AD的作用机制。方法：海马区注射Aβ25-35建立AD大鼠模型，用黑逍遥散、石杉碱甲进行对抗治疗，第28天取血清，通过酶联免疫吸附法（ELISA）测定AD大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量。结果：模型组大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量显著升高，各治疗组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量均有所降低，黑逍遥散高剂量组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量显著降低。结论：有效控制AD患者体内炎性因子表达是黑逍遥散的重要作用机制。

阿尔茨海默病；黑逍遥散；炎性因子

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)又称老年性痴呆，是一种以认知功能下降为特征的渐进性脑退化综合征，是老年期痴呆的主要类型。目前AD的病因尚不明确，近年来有证据显示炎性细胞因子(CK)参与AD的神经病理损伤，血清中肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素(IL-6、IL-1β)水平升高在AD发病机制中起重要作用[1]。中医学认为，脑与肝肾密切相关，本课题组提出运用黑逍遥散治疗AD。前期研究证明黑逍遥散能明显改善AD模型大鼠的学习记忆能力[2]，本实验观察黑逍遥散对AD模型大鼠血清中炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的影响，探讨其对AD的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级Wistar大鼠100只，体质量(200±20)g，雌雄各半，由甘肃中医学院科研实验动物中心提供，实验动物质量合格证编号：SYXK(甘)2013-0001058。

1.2 药物与试剂 黑逍遥散(熟地黄、柴胡、当归等)各组成生药由甘肃中医学院附属医院中药房提供。制成浓度为2.0、1.0、0.5 g/mL的水煎液。放置于无菌容器中，4℃冰箱保存备用；石杉碱甲片购自河南太龙药业股份有限公司，批号：130402，配制成浓度为0.001 8mg/mL水溶液，4℃冰箱保存备用；Aβ25-35购自上海强耀生物科技有限公司，批号：20130309。将Aβ25-35 10μg溶于生理盐水1μL，使用前37℃孵育1周，使其呈凝聚态备用；IL-1、IL-6、TNF-α酶联免疫检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，批号：20130609。

1.3 仪器 WT-200型大鼠脑立体定位仪(成都泰盟科技有限公司提供)、酶标仪(美国伯乐公司提供)、微量进样器(上海安亭微量进样器厂提供)。

1.4 方法

1.4.1 模型复制 模型大鼠腹腔注射10%水合氯醛(300mg/kg)麻醉，固定于立体定位仪上，确定海马区注射点。用牙科钻在颅骨上钻孔(直径1mm)，用微量进样器在两侧各缓慢注射Aβ25-35溶液1μL，5分钟内注射完，留针5分钟，牙科泥封住颅骨孔，术区滴庆大霉素，缝合皮肤并消毒。假手术组注射等量生理盐水，其余同模型组。

1.4.2 分组及给药 100只大鼠经环境适应性饲养1周后称重，按随机数字表法选15只大鼠为假手术组，剩余大鼠造模7天后（除去死亡等不合格大鼠10只）称重，再按随机数字表法将大鼠分为模型组、石杉碱甲组、黑逍遥散高、中、低剂量组，每组15只。治疗组各组处方量均按照《中药药理研究方法学》人与实验动物体表面积折算等效剂量比换算，黑逍遥散各组大鼠分别按低剂量组4.25 g/(kg·d)、中剂量8.50 g/(kg·d)、高剂量17.0 g/(kg·d)灌胃给药；石杉碱甲组每天灌胃石杉碱甲溶液0.018mg/kg；假手术组、模型组大鼠每天灌胃等容量生理盐水，连续治疗28天。

1.4.3 大鼠血清采集及测定IL-1β、IL-6及TNF-α治疗28天后，将大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉，股静脉取血。静置2小时后，4℃、3 000 r/min离心10分钟，取血清置Eppendor f管中，4℃冰箱保存待测。血清IL-1、IL-6及TNF-α测定均采用酶联免疫吸附双抗体夹心法(ELISA)，按试剂盒操作说明进行。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计学处理，计量资料采用(±s)表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

与假手术组比较，模型组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；与模型组比较，各治疗组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05)；与石杉碱甲组比较，中低剂量组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；高剂量组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 黑逍遥散对AD大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量的影响 pg/mL

3 讨论

AD临床上表现为进行性认知障碍和精神异常，其病理特征为脑皮层及海马区出现β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein，Aβ)聚集形成老年斑(seni le plaque，SP)，Tau蛋白异常聚集形成神经纤维缠结，其中老年斑伴有神经元突起损伤和小胶质细胞的活化。研究表明AD患者脑内存在强烈的局灶性炎症反应，淀粉样斑块附近激活的小胶质细胞可表达IL-1β、IL-6及TNF-α等多种炎性因子［3］。小胶质细胞属于单核巨噬细胞，正常情况下处于静息状态，Aβ形成后可激活神经系统中小胶质细胞，释放大量炎性因子，诱发脑内炎症反应或者直接损伤神经元［4］。同时炎性因子介导的炎性反应又可以促进Aβ的前体蛋白(APP)代谢为Aβ，从而加重炎性反应，形成恶性循环［5］。TNF-α是由小胶质细胞受Aβ刺激后产生的神经毒素，通过N-甲基-D-天门冬氨酸对神经元产生毒性作用［6］，此外TNF-α协同IL-1强烈诱导IL-6产生，研究发现IL-6诱导急性期蛋白A-2巨球蛋白的表达，其中A-2巨球蛋白的多态性使β-APP的正常酶解受到抑制，导致Aβ生成［7］。IL-1β可以诱发炎性反应，在细胞及体液免疫中起始动作用，IL-1β过度表达，可上调小胶质细胞表达IL-6、TNF-α等炎性因子，诱导APP过度生成；IL-1β还可激活丝裂原活化蛋白激酶P38的信号传导通路，使Tau蛋白过度磷酸化，促进神经纤维缠结［8］。

黑逍遥散出自《医略六书·女科指要》，由逍遥散加地黄组成，具有疏肝解郁，滋阴养血，益精填髓的功效。祖国医学认为，AD病在脑，与肝藏密切相关，肝主疏泄，调畅气机，又主藏血，调节血量，因此脑的供血赖于肝所藏之血及其疏泄功能。AD有记忆力减退，智力下降，情感失控等症状，与肝主情志思忆相关。老年人的病理基础为肾精亏虚，不能生髓充脑，脑失滋养，渐成痴呆。本次实验结果显示，黑逍遥散各剂量组均能降低AD模型大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量，而黑逍遥散高剂量组较石杉碱甲组效果更明显，说明高剂量黑逍遥散可能通过抑制炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达来防治AD。

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［2］ 吴红彦，王虎平，王彩霞.黑逍遥散对老年性痴呆的防治作用及其机制研究［J］.时珍国医国药，2011，4(22):912-913.

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Effectsof HeiXiaoYao Pow der on the Behavior and the TNF-α,IL-6 and IL-1βContentsof Alzheim er D isease RatM odels

YANG Changsheng,WU Hongyan△,LIHailong,RONG Qianqian
Gansu University of Chinese Medicine,Lanzhou 730000,China

Objective:To observe the effectof HeiXiaoYao powder on the ratsw ith A lzheimer disease(AD) induced by Aβ25-35 in the expression of tumornecrosis factor(TNF-α),interleukin-1β(IL-1β)and interleukin-6 (IL-6)in blood serum and to study the functionalmechanism of HeiXiaoYao powder in the prevention and treatment of AD.Methods:A fter the establishment of the AD ratmodels by injecting Aβ25-35 in the hippocampus,the models were treated by HeiXiaoYao powder and huperzine A.On the 28th day,the contents of TNF-α,IL-6 andIL-1βin the serum of themodelswere exam ined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).Results:The TNF-α,IL-6 and IL-1βcontents of the control group were increased hugely,while in the treatment group the contentsof TNF-α,IL-6 and IL-1βwere all decreased and the HeiXiaoYao powdergroup of high dosewere significantly decreased.Conclusion:The HeiXiaoYao powder can effectively control the expression of the inflammatory factor for AD patients,which isoneof importantmechanismsof HeiXiaoYao powder.

AD;HeiXiaoYao powder;inflammatory factor

R285.6

A

1004-6852(2015)02-0010-03

2014-07-29

国家自然科学基金项目(编号81060284)。

杨长生（1983—）女，在读硕士研究生。研究方向：方剂作用机理及药效基础物质研究。

△通讯作者：吴红彦（1963—）男，教授。研究方向：方剂药理与新药开发。