甲状腺乳头状癌BRAFV600E 突变表达及其与临床病理特征的相关性研究

林维浩，马浙夫，夏浩明 (中山大学附属第一医院乳腺甲状腺外科，广东 广州 510080)

甲状腺癌是最常见的内分泌系统恶性肿瘤，在头颈部肿瘤中居首位。近30 年来，我国的甲状腺癌发病率由10/100 万上升约30/100 万～40/100 万［1］。甲状腺癌的病理类型包括乳头状癌(PTC)、滤泡状癌(FTC)，未分化癌(ATC)和髓样癌(MTC)，其中PTC 占成人的60%和儿童甲状腺癌的全部［2］。甲状腺癌的发生包含了一系列高发的遗传学因素，如RAS 基因点突变、RET 基因重排、p53 基因失活等。BRAF 突变是近年来发现的一个重要基因突变，且BRAFV600E突变成为近年来研究的热点。本文通过检测BRAFV600E在PTC 中的表达，探讨其表达与PTC 临床病理特征关系，为预测PTC 的局部复发与治疗寻找新途径。

1 资料与方法

1.1 标本来源:选取2003 年1 月～2005 年8 月于中山大学附属第一医院行手术切除的PTC 石蜡包埋切片140 例，其中男35例，女105 例;年龄8 ～78 岁，平均(38.6±2.6)岁，中位年龄36.7 岁;Ⅰ～Ⅱ期88 例，Ⅲ～Ⅳ期52 例。所有患者术前均未行内、外放射治疗，首次术后原发灶无癌残留。临床资料见表1。

表1 140 例PTC 的临床资料

1.2 BRAF 突变检测:对140 例PTC 病理阅片，将石蜡包埋的甲状腺癌组织切片通过脱蜡、经典阴离子去污剂法进行基因组DNA 提取。将提取的DNA 行Taqman 荧光定量PCR 检测。

1.3 BRAFV600E突变结果的判断:以已知的PTC 细胞WRO 和KAT－5 细胞提取的DNA 作为对照。将PTC 细胞系WRO 作为BRAF 野生型为阴性对照，PTC 细胞系KAT－5 为BRAFV600E突变的阳性对照。

1.4 研究方法:对140 例PTC 病理学观察、DNA 提取，采用Taqman 荧光定量PCR 检测突变的结果，与已知PTC 细胞系WRO 作为BRAF 野生型、KAT－5 为BRAFV600E突变型的结果作对照，分析BRAFV600E突变在PTC 中不同亚型的表达与临床病理特征与预后的关系。

1.5 统计学方法:采用SPSS17.0 统计软件对实验数据进行分析，BRAFV600E基因突变与PTC 患者临床病理特征之间的关系用卡方检验，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BRAFV600E与PTC 临床病理特征的相关性:140 例患者中，BRAFV600E突变检测阳性75 例，阴性65 例，突变率为53.6%。BRAFV600E突变与性别、年龄、肿瘤大小、腺外侵袭之间的关系经χ2检验差异均无统计学意义(P ＞0.05)，但有颈部淋巴结转移患者的BRAFV600E突变率显著高于无颈部淋巴结转移患者，差异具有显著统计学意义(P ＜0.01);Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期间的BRAFV600E突变率差异具有显著统计学意义(P ＜0.01)，见表2。

表2 BRAFV600E与PTC 临床病理特征的关系

2.2 随访:140 例PTC 患者均通过门诊、电话及信件等方式随访。随访时间96.3 ～120.1 个月，平均104.36 个月，20 例失访，随访率85%。14 例术后再次手术，其中10 例因局部淋巴结转移，检测BRAFV600E阳性8 例(8/14);4 例因局部复发，检测BRAFV600E阳性2 例(2/4)。3 例在术后5 年内死亡，死因为全身转移或局部复发窒息(检测BRAFV600E阳性2 例，阴性1 例)。BRAFV600E突变与复发率、死亡率经χ2检验差异无统计学意义，差异均无统计学意义。见表3。

表3 BRAFV600E与PTC 术后随访的关系(n=120)

3 讨论

BRAF 基因属于RAF 基因家族，是MAPK 通路的一个重要蛋白激酶。它位于染色体7q34，编码一个分子量为67 ～99 kD的丝/苏氨酸蛋白激酶。RAF 基因家族共有三个成员，RAF－1、BRAF 和ARAF。在RAF 家族三种丝/苏氨酸蛋白激酶中，BRAF 是激活MAPK 通路的能力最强的的激活物。BRAF 突变在人类肿瘤最常见于黑色素瘤，其检出率占所有的黑色素瘤的66%，肠癌、肺癌、卵巢癌和甲状腺癌中也有一定的发生率［3］。大部分的BRAF 突变都限定于激酶结构域内，其热点突变在11和15 外显子上。超过80%的BRAF 突变都为第1799 位脱氧核苷酸的A－T 点突变，这种突变导致第600 位氨基酸由缬氨酸变为谷氨酸。这一突变带来的负电荷模拟了苏氨酸599 和丝氨酸602 的磷酸酰基化过程，导致激酶的持续活化，MAPK 通路持续激活，使前者原有丝分裂能力增强，引起细胞异常增殖和恶性转化，导致肿瘤的发生。BRAF 突变在PTC 中有很高的发生率，从29%至83%不等。西方国家PTC 中BRAFV600E突变的检出率较韩国低［4］。本研究BRAFV600E检出率为53.6%，与西方国家检出率相仿。

国外有不少关于BRAFV600E突变与甲状腺癌临床病理学参数相关性研究，但目前对于BRAFV600E可否作为预后不良的指标存在较大争议。有国外学者认为PTC 中BRAFV600E突变与远处转移和临床病理分期有显著相关性［5］。而国内的研究资料显示腺外侵犯、颈淋巴结转移和甲状腺癌处于进展期(Ⅲ～Ⅳ期)均与PTC 的BRAFV600E突变有显著相关性［6］但也有研究认为突变与各参数不存在相关性［7］。本研究发现BRAFV600E突变与患者的性别、年龄、肿瘤大小和腺外浸润不相关。由于远处器官转移的例数较少(n=2)，暂不能得到BRAFV600E突变与远处转移不相关的结论。研究发现PTC 中BRAFV600E突变有较高的复发、死亡率，因为本研究中复发、死亡的PTC 病例较少，所以BRAFV600E突变与PTC 的关系还需要进一步研究。BRAFV600E突变与甲状腺癌的淋巴结转移和临床分期显著相关。这些结果提示，BRAFV600E突变与甲状腺癌的临床进展相关，其有可能参与了甲状腺癌的恶性演进。

检测BRAFV600E突变对PTC 患者治疗和术后预测复发有指导作用。初次手术方式和切除范围的选择是临床医生遇到的最常见的问题［8］，如是否应该予以甲状腺全切术，是否应该行颈部淋巴清扫术，以及术后是否选择放射性碘治疗［8］。在美国和其他国家，甲状腺全切或甲状腺次全切除术后予以放射性碘治疗是高危PTC 患者的标准治疗方案［9］。高危的PTC 患者放射性碘治疗对预防复发，提高生存率的作用已经得到广泛证实。由于BRAFV600E阳性的患者在肿瘤复发后对碘放射治疗不敏感，建议手术切除范围应更广泛，并需要外放射治疗［6］。目前有人主张对于BRAFV600E阳性的患者，可以考虑预防性的中央组淋巴结清扫，因为这类患者可能存在肉眼下难以发现的微转移，且甲状腺细胞功能摄碘功能受损，对放射性碘治疗不敏感，复发和死亡风险更大。此外BRAFV600E阳性的患者肿瘤有较高的复发率，术后需更严格随访以检测是否复发。本文研究发现BRAFV600E阳性有较高的复发率，及局部淋巴结转移。手术切除范围应更广泛，患者为此能否获益，需要进一步随访研究。

目前甲状腺癌治疗效果良好，然而，首次正规治疗后10 年仍有20%的患者复发。对于手术不能根治、内放射治疗不敏感的和分化程度较低的PTC 和ATC，目前仍缺乏有效治疗手段。PTC 对常规化疗药物不敏感，不良反应大，研究发现BRAF 突变与细胞的恶性转化密切相关，抑制BRAF 编码的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性对治疗PTC、改善患者预后具有重要意义。实验证明RAS 点突变或RET 基因重排，MAPK 激酶抑制剂对BRAF 突变阳性的甲状腺癌细胞具有强的生长抑制作用［9］。抑制MAPK 活性还可以恢复碘代谢相关基因的正常表达，提高对放射碘治疗不敏感PTC 患者的摄碘率［10－11］。近年发现MAPK激酶的抑制剂Selumetinib 可以提高抗碘的甲状腺癌患者的摄碘率［12］。针对MAPK 激酶途径的抑制剂可望会成为有效的PTC 治疗药物。

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