雷公藤多苷通过抑制TLR4/NF-κB信号通路抑制小鼠结肠炎症

朱 灵 周 军 曹海军 钟继红 刘 军 胡华军 李善高#

浙江中医药大学附属第一医院消化科1(310006) 浙江中医药大学附属第二医院消化科2中国计量学院生命科学学院分子生物学教研室3

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种慢性非特异性结肠炎症，病情易反复发作，难以治愈，且至今仍缺乏特效且不良反应少的治疗药物。UC发病机制不明，多数学者认为与肠黏膜免疫反应异常有关［1-2］。雷公藤多苷是提取自卫矛科植物雷公藤的苷类制剂，具有较强的抗炎和免疫调节作用［3］。临床实践中，雷公藤多苷对UC具有良好的疗效，但确切机制不明。本实验采用葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导小鼠结肠炎模型以模拟人类UC，并予雷公藤多苷干预，旨在探讨雷公藤多苷对UC的治疗作用及其可能机制。

材料与方法

一、实验动物和主要试剂

健康雄性BALB/c小鼠60只，8周龄，体质量(20±2)g，购自浙江中医药大学动物实验研究中心，动物生产许可证号:SYXK(浙)2003-2003。右旋DSS(Sigma-Aldrich Co.LLC.)使用时配制成浓度5%的溶液(5 mg DSS溶于100 mL蒸馏水中);雷公藤多苷片(国药准字Z33020422，浙江得恩德制药有限公司)使用时根据人和小鼠体表面积换算用药剂量，以蒸馏水配制成低、中、高浓度混悬液(0.45、1.35、4.05 mg/mL);TRIzol®试剂、SuperScript®Ⅱ逆转录酶、AmpliTaq®PCR试剂盒(Thermo Fisher Scientific Inc.);Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)小鼠单克隆抗体(Abcam plc.);EnVision二步法免疫组化试剂盒(DAKO公司);NF-κB p65兔多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology，Inc.);小鼠白细胞介素-1α(IL-1α)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-13 ELISA 试剂盒(R＆D Systems，Inc.)。

二、方法

1.实验动物分组和处理:小鼠适应性喂养7 d后随机分为6组，分别为模型对照组，低、中、高剂量雷公藤多苷组、空白对照组和正常对照组，每组10只。第1周模型对照组和各组雷公藤多苷组自由饮用5%DSS溶液，同时每天一次以蒸馏水0.2 mL/10 g或相应浓度雷公藤多苷混悬液0.2 mL/10 g灌胃［雷公藤多苷剂量分别为9.01、27.03、81.09 mg/(kg·d)］，空白对照组和正常对照组自由饮用纯净水。造模过程中每天观察、记录小鼠粪便性状、精神、活动情况、体质量等。第8天每组随机取1只小鼠处死，用于观察结肠组织大体形态和组织病理学改变。模型建立成功与否根据稀便、粪便带血、体质量减轻等症状以及结肠组织病理学改变综合判定。第2～3周，各组小鼠均自由饮用纯净水，模型对照组和各组雷公藤多苷组继续每天一次以蒸馏水或相应浓度雷公藤多苷混悬液灌胃。第22天，除正常对照组外，各组小鼠均腹腔注射脂多糖(LPS)100μg(用以激活 TLR4/NF-κB信号通路，启动下游炎症因子释放)，24 h后处死，取结肠组织，观察大体形态，取肉眼病变最明显处行相关检测。

2.结肠组织病理学检查:肉眼观察结肠组织黏膜和浆膜面变化，取肉眼病变最明显处结肠组织约1.0 cm×1.0 cm×0.2 cm，4%甲醛溶液固定24 h，石蜡包埋，3～4μm厚连续切片，HE染色，光学显微镜下观察并行组织病理学评分［4］。

3.RT-PCR检测TLR4 mRNA表达:以TRIzol®试剂提取结肠组织总RNA，紫外分光光度法测定浓度和纯度。将RNA逆转录成cDNA，以之为模板行PCR扩增，操作按相应试剂盒说明书进行。小鼠TLR4引物序列:5’-CAC CTG GGG CTC TGC TAT GGA-3’，5’-CCC CTG GAA AGG AAG GTG TC-3’。PCR反应条件:95℃ 1 min;95℃ 10 s，64℃ 25 s，40个循环。PCR产物行 l%琼脂糖凝胶电泳，GelDoc XR凝胶成像系统成像，TLR4 mRNA相对表达量以内参β-actin进行校正。

4.蛋白质印迹法检测TLR4蛋白表达:结肠组织匀浆后加入蛋白裂解液和PMSF提取总蛋白，测定总蛋白含量。上样、电泳、转膜、染色、去离子水震荡去除浮色，5%脱脂奶粉封闭，4℃过夜，加入TLR4小鼠单克隆抗体(1∶500)，4℃孵育过夜，洗涤后加入二抗(1∶2000)，室温孵育1 h，洗涤后加入底物孵育，取出硝酸纤维素膜，蒸馏水漂洗后晾干，UVI凝胶成像系统测定蛋白条带灰度值，分析TLR4蛋白相对表达量。

5.免疫组化染色检测NF-κB p65表达:采用EnVision二步法。结肠组织切片脱蜡，水化，热修复，3%H2O2阻断内源性过氧化物酶;加入NF-κB p65兔多克隆抗体，孵育60 mim，蒸馏水漂洗，置于PBS中;加入山羊抗兔IgG-HRP多聚体，孵育40 min，蒸馏水漂洗，置于PBS中;DAB显色3 min，显微镜下控制反应，自来水冲洗终止反应;蒸馏水漂洗，复染，封片。胞质和(或)胞核内出现黄色、棕色颗粒判定为阳性细胞，根据阳性细胞比率与阳性染色强度行免疫组化评分(IHC评分)［5］。

6.ELISA 法检测 IL-1α、TNF-α、IL-13 浓度:结肠组织切成2～3 mm3的小块，放入组织匀浆器中，加入适量PBS，冰上研磨，研磨产物12000×g 4℃离心15 min，取上清液分装，-80℃保存待测。按相应ELISA试剂盒说明书进行操作，测定结肠组织匀浆上清中的 IL-1α、TNF-α、IL-13 浓度。

三、统计学分析

结 果

一、一般情况

造模过程中无动物死亡。造模第3天，模型对照组和雷公藤多苷组小鼠出现少动、进食少、毛色失去光泽、精神倦怠以及不同程度的腹泻、肉眼便血、肛门血染，体质量明显下降，各组雷公藤多苷组上述表现均轻于模型对照组;空白对照组和正常对照组未观察到上述异常表现。

二、结肠组织病理学改变

造模第8天，模型对照组可见结肠黏膜充血水肿，中性粒细胞浸润。实验结束后，模型对照组可见黏膜溃疡，结肠肉芽组织增生，溃疡周边腺体可见增生，黏膜和黏膜下层以淋巴细胞、浆细胞等慢性炎性细胞浸润为主;各组雷公藤多苷组结肠黏膜均未见溃疡，结肠组织水肿充血，少量慢性炎性细胞浸润，中、高剂量组上述病理改变轻于低剂量组;空白对照组和正常对照组结肠黏膜完整、光滑，腺体层次清楚，未见糜烂、溃疡、炎性细胞浸润等改变(图1)。各组雷公藤多苷组、空白对照组和正常对照组结肠组织病理学评分均显著低于模型对照组(P＜0.05)，中、高剂量雷公藤多苷组间差异无统计学意义(P＞0.05)，均显著低于低剂量组(P＜0.05)，但仍高于空白对照组和正常对照组(P＜0.01)(表1)。

图1 各组小鼠结肠组织病理学表现(HE染色，×100)

三、结肠组织TLR4表达

RT-PCR和蛋白质印迹法检测显示，各组雷公藤多苷组、空白对照组和正常对照组结肠黏膜组织TLR4 mRNA和蛋白表达水平均显著低于模型对照组(P＜0.01);中、高剂量雷公藤多苷组间差异无统计学意义(P＞0.05)，均显著低于低剂量组(P＜0.01)，但仍高于空白对照组和正常对照组(P＜0.01)(图2)。

四、结肠组织NF-κB p65表达和定位

NF-κB p65免疫组化阳性物质主要定位于结肠黏膜上皮细胞、炎性细胞、肌间神经丛、神经元细胞等。正常对照组和空白对照组结肠黏膜组织NF-κB p65为弱阳性表达，两组间IHC评分差异无统计学意义(P＞0.05);模型对照组和各组雷公藤多苷组结肠黏膜上皮、黏膜下层NF-κB p65呈强阳性表达，以胞核表达为主，炎症黏膜上皮区表达强度远高于非炎症黏膜上皮区，此现象在模型对照组尤为明显，其IHC评分显著高于各组雷公藤多苷组(P＜0.01);中、高剂量雷公藤多苷组间差异无统计学意义(P＞0.05)，均显著低于低剂量组(P＜0.01)(图3、表1)。

五、结肠组织 IL-1α、TNF-α、IL-13 含量

各组雷公藤多苷组、空白对照组和正常对照组结肠黏膜组织匀浆上清中的IL-1α、TNF-α含量均显著低于模型对照组(P＜0.01)，中、高剂量雷公藤多苷组间IL-1α含量差异无统计学意义(P＞0.05)，TNF-α含量高剂量组显著低于中剂量组(P＜0.01)，中、高剂量组IL-1α、TNF-α含量均显著低于低剂量组(P＜0.05)，但仍高于空白对照组和正常对照组(P＜0.05);各组间IL-13含量差异无统计学意义(P＞0.05)(表1)。

图2 各组小鼠结肠组织TLR4 mRNA(A)和TLR4蛋白(B)表达

图3 各组小鼠结肠组织NF-κB p65表达(免疫组化EnVision二步法，×200)

表1各组小鼠结肠组织病理学评分、NF-κB p65 IHC评分以及IL-1α、TNF-α、IL-13含量比较)

表1各组小鼠结肠组织病理学评分、NF-κB p65 IHC评分以及IL-1α、TNF-α、IL-13含量比较)

与模型对照组比较，aP＜0.01，bP＜0.05;与空白对照组和正常对照组比较，cP＜0.01，dP＜0.05各组雷公藤多苷组间比较:与低剂量组比较，eP＜0.01，fP＜0.05;与中剂量组比较，gP＜0.01，hP＜0.05

讨 论

迄今为止，UC的病因和发病机制仍未明确，主流观点认为UC是免疫、遗传、环境、肠道菌群等多种因素共同作用的结果，免疫功能紊乱是UC的重要致病因素之一［1-2］。临床常用的UC治疗药物主要包括氨基水杨酸类、糖皮质激素、免疫抑制剂等，但用于维持缓解治疗时存在诸多不良反应且复发率较高，难以长期使用。寻找高效、低不良反应、能长期使用的UC维持缓解治疗药物迫在眉睫。

雷公藤多苷是中药雷公藤的有效成分，具有很强的抗炎和免疫调节作用，能抑制多种细胞因子表达，如 IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-17、IL-23、TNF-α等［3，6-7］。研究显示雷公藤多苷能有效抑制结肠炎动物模型的肠道炎症反应和组织学损伤［6-7］，但其具体作用机制尚未完全阐明。

近年来，TLRs在炎症性肠病(IBD)中的作用逐渐成为IBD研究领域的一大热点。模式识别受体(PRRs)TLRs是先天免疫系统的关键调控分子，其可识别并结合多种类型的病原体相关分子模式(PAMPs)和损伤相关分子模式(DAMPs)，继而激活相应细胞内信号转导通路，导致效应分子表达、分泌，从而针对不同外界刺激产生特定的生物学功能。TLR4是第一个被发现的TLRs，其主要负责识别革兰阴性菌胞壁成分LPS，启动相关信号通路，最终导致NF-κB激活及其下游促炎细胞因子表达。研究显示TLR4在IBD患者的结肠炎症黏膜中呈异常高表达，在非炎症黏膜中的表达则与对照者无明显差异［8-10］，而正常人肠上皮细胞中TLR4表达水平极低且不表达TLR4信号通路中的关键共受体MD-2，故正常肠黏膜对肠道革兰阴性共生菌的LPS呈低反应性，不由此激活 NF-κB，引起炎症反应［11］。另有研究［12］发现，TLR4拮抗剂可阻断LPS刺激引起的促炎基因表达，抑制小鼠模型的结肠炎症。上述研究结果均表明TLR4及其介导的信号通路是UC发病过程中的重要环节之一。

NF-κB为一普遍存在于细胞质中的转录因子，主要由p65和p50两个亚单位结合成二聚体或异二聚体，其中p65为其主要功能亚单位，具有显著促炎活性。静息状态下，NF-κB二聚体与抑制蛋白IκBα形成复合体，以无活性形式存在于细胞质中;细胞接收外界刺激信号后，IκBα被磷酸化而从复合体脱落，游离的NF-κB易位至细胞核内，与靶DNA序列结合，诱导下游促炎基因表达，促进促炎细胞因子如 IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α 等释放，这些细胞因子又进一步激活NF-κB，形成正反馈调节，使炎症反应放大［13］。大量研究表明，TLR4/NF-κB 信号通路在UC中发挥至关重要的作用，雷公藤多苷对UC肠道炎症的抑制作用是否与抑制该信号通路有关，相关文献报道尚少。

本实验予小鼠自由饮用5%DSS溶液成功复制了与人类UC类似的结肠炎动物模型，同时予不同剂量雷公藤多苷干预，通过检测结肠炎症黏膜组织中的TLR4、NF-κB p65表达以及促炎细胞因子 IL-1α、TNF-α和抗炎细胞因子IL-13分泌，探讨雷公藤多苷对UC的治疗作用及其可能机制。实验结果显示，模型对照组和各组雷公藤多苷组结肠黏膜组织TLR4、NF-κB p65 表达和 IL-1α、TNF-α 分泌均显著高于仅予LPS刺激的空白对照组和不予任何处理的正常对照组，且表达变化与结肠组织病理学改变基本一致，与国内外文献报道相符［6，8-10，14-15］，其可能机制为:模型小鼠肠道黏膜免疫反应异常，TLR4/NF-κB信号通路被LPS激活，释放各种炎症因子如IL-1α、TNF-α等，引发结肠炎症反应，进而导致组织损伤。而空白对照组和正常对照组结肠黏膜组织TLR4、NF-κB p65表达和促炎细胞因子分泌均处于低水平状态，与正常肠道黏膜的内环境稳态(对TLR4配体LPS处于长期免疫耐受状态)有关。本实验发现结肠炎模型小鼠经雷公藤多苷干预后，结肠黏膜组织 TLR4、NF-κB p65 表达和 IL-1α、TNF-α分泌均显著下降，结肠组织病理学改变相应减轻，以中、高剂量组为著，表明雷公藤多苷对DSS诱导的小鼠结肠炎具有良好的保护作用，其防治UC发生、发展的作用在一定范围内与用药剂量有关。本实验中雷公藤多苷干预对结肠炎模型小鼠结肠黏膜组织抗炎细胞因子IL-13分泌无明显影响，表明雷公藤多苷对UC的保护作用并非通过调控抗炎细胞因子表达、分泌而实现。

综上所述，根据本实验研究结果，雷公藤多苷对DSS小鼠结肠炎有良好的保护作用，其可能通过抑制结肠黏膜组织TLR4表达，进而抑制TLR4/NF-κB信号通路激活及其下游促炎细胞因子表达、分泌而抑制结肠炎症反应。后续将进一步研究雷公藤多苷抑制TLR4/NF-κB信号通路的具体分子机制，确定该信号通路中的关键分子以及雷公藤多苷的最适剂量，为临床上应用雷公藤多苷治疗UC提供实验依据。

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