替普瑞酮对急性胰腺炎大鼠肠黏膜屏障保护作用的实验研究*

郭晓榕 刘 晓 李 洁 吴 敏 湛先保

第二军医大学长海医院消化内科(200433)

肠黏膜屏障功能损害是急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)发生、发展的关键环节，与疾病预后密切相关［1-2］。正常情况下，肠黏膜与黏膜下层之间有一道具有高度选择性的机械屏障，上皮细胞间连接复合体和主要紧密连接结构由多种蛋白组成，其中 occludin和 ZO-1(zonula occludens-1)蛋白对维持正常屏障结构和功能具有重要意义［3］。替普瑞酮(teprenone)为临床常用胃黏膜保护剂，其在治疗胃炎、胃溃疡、防治乙醇、非甾体消炎药(NSAIDs)等因素相关性胃黏膜损伤中的作用已得到广泛认可［4-5］，对于各种原因引起的肠黏膜损伤，替普瑞酮同样发挥重要保护作用［5-8］。本实验以腹部皮下注射雨蛙素(cerulein)建立水肿型AP大鼠模型，并予替普瑞酮灌胃干预，通过观察血清促炎细胞因子白细胞介素-1(IL-1)、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平、肠黏膜形态学以及上皮细胞间紧密连接蛋白occludin、ZO-1表达的变化，探讨替普瑞酮对AP肠黏膜屏障的保护作用及其可能机制，为替普瑞酮应用于AP临床治疗提供理论依据。

材料与方法

一、实验动物和主要试剂

健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠45只，体质量180～220 g(第二军医大学动物实验中心)。替普瑞酮［卫材(中国)药业有限公司］于使用前配制成新鲜混悬液;雨蛙素(Sigma-Aldrich Co.);IL-1、IL-6、TNF-α ELISA 试剂盒(Takara Bio Company);淀粉酶ELISA试剂盒(QIAGEN);羊抗鼠occludin、ZO-1 单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology，Inc.);荧光标记兔抗羊二抗(Cell Signaling Technology，Inc.，工作浓度 1∶100)。

二、方法

1.水肿型AP大鼠模型建立和分组:采用随机数字表法将大鼠分为3组:正常对照组(n=5)、AP模型组(n=20)和替普瑞酮治疗组(n=20)。实验前12 h禁食，不限饮水，造模大鼠腹部皮下注射雨蛙素20μg/(kg·h)，共4次;正常对照组大鼠腹部皮下注射等体积0.9%NaCl溶液。替普瑞酮治疗组于造模前2 h和造模后2 h予替普瑞酮1000 mg/kg灌胃。术后12 h麻醉、处死大鼠，心脏穿刺取血，离心取上清液，－20℃保存待测。打开腹腔分离小肠，取距回盲部5 cm处回肠组织，0.9%NaCl溶液漂洗，用于后续检查。

2.血清促炎细胞因子和淀粉酶检测:采用双抗体夹心ELISA法检测血清IL-1、IL-6、TNF-α和淀粉酶水平，按试剂盒说明书进行操作。

3.组织病理学检查:回肠组织标本4%甲醛溶液固定，石蜡包埋，4～5μm厚连续切片，常规HE染色，光学显微镜下每张切片随机选取20个高倍视野进行观察。

4.超微结构观察:回肠组织标本2.5%戊二醛溶液4℃前固定2 h以上，PBS漂洗3次，1%锇酸后固定约1 h，1%乙酸铀块染2 h，梯度丙酮脱水，逐步浸透包埋，修块后半薄切片光学显微镜下定位，每张切片随机选取50个高倍视野，日立H-7500型透射电子显微镜下观察。

5.蛋白质印迹法检测 occludin、ZO-1蛋白表达:回肠组织剪碎后加入 RIPA 300μL、PMSF 5μL研磨匀浆1 min，转移至EP管，冰上放置30 min，期间振荡3次，离心取上清液，BCA法测定蛋白浓度。蛋白上样，SDS-PAGE电泳，半干转印于硝酸纤维素膜，分别加入一抗和二抗孵育，LI-COR Odyssey双色红外激光成像系统观察、拍照。

三、统计学分析

结 果

一、血清促炎细胞因子和淀粉酶水平

与正常对照组相比，AP模型组血清IL-1、IL-6、TNF-α和淀粉酶水平显著升高，提示炎症反应增强，而替普瑞酮治疗组各项指标均较AP模型组显著降低，提示替普瑞酮干预对AP时的全身性炎性反应和胰腺组织破坏有一定抑制作用(表1)。

二、小肠黏膜组织病理学变化

正常对照组小肠黏膜绒毛完整，黏膜下层次结构清楚;AP模型组小肠黏膜水肿变性，绒毛坏死脱落，局部上皮细胞与固有层分离;替普瑞酮治疗组仅出现黏膜下层炎性细胞浸润，小肠绒毛仍较完整，未见坏死脱落，提示替普瑞酮干预对AP时的小肠黏膜完整性有一定保护作用(图1)。

三、小肠黏膜超微结构变化

正常对照组小肠黏膜上皮细胞微绒毛结构完整，细胞间紧密连接致密;AP模型组微绒毛脱落、断裂，紧密连接明显增宽，与组织病理学变化相一致;替普瑞酮治疗组微绒毛和紧密连接破坏较AP模型组明显改善，形态接近正常对照组，提示替普瑞酮干预对AP时的小肠黏膜超微结构有一定保护作用(图2)。

四、小肠黏膜occludin、ZO-1蛋白表达

与正常对照组相比，AP模型组小肠黏膜组织occludin、ZO-1蛋白表达明显下调，而替普瑞酮治疗组两种蛋白表达均较AP模型组增强，提示替普瑞酮干预可增强AP时的小肠黏膜上皮细胞间紧密连接蛋白表达(图3)。

图1 各组大鼠小肠黏膜组织病理学变化(HE染色，×200)

图3 各组大鼠小肠黏膜occludin、ZO-1蛋白表达(蛋白质印迹法)

讨 论

肠黏膜屏障由机械屏障、化学屏障、生物屏障、免疫屏障等组成，不同屏障的结构、分子调控机制和生物学功能各不相同，协同防御外来物质的侵袭［9-10］。肠黏膜上皮细胞间的紧密连接结构包绕在上皮细胞靠近肠腔的一侧，受细胞因子调节，影响整个肠黏膜屏障的通透性。该结构可有效阻止肠腔内细菌、毒素、炎性介质等的旁细胞转运，维持肠黏膜上皮屏障功能的完整性［11-12］。重症急性胰腺炎(SAP)时，肠道不仅是脓毒症的靶器官，更是全身性炎症反应综合征(SIRS)以及局部和全身感染的启动部位，肠黏膜屏障功能受损致黏膜通透性增高，细菌和内毒素易位，导致内皮细胞活化，释放炎性介质和细胞因子，启动SIRS并引起多器官功能障碍综合征(MODS);同时，细菌和毒素进入循环后引起胰腺及其周围组织继发感染，是SAP患者死亡的主要原因［13-14］。因此，研究肠黏膜屏障的损伤机制，并采取相应防治措施，对于改善AP患者的预后具有重要意义。

表1 各组大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α和淀粉酶水平比较

替普瑞酮作为一种抗溃疡药，已被证实在胃黏膜细胞保护中起重要作用。2005年Ohkawara等［7］发现替普瑞酮对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠结肠炎具有保护效应，表明替普瑞酮在肠道细胞保护中亦发挥重要作用。Iwai等［8］评估了替普瑞酮对小肠黏膜的保护效应，发现其可增加大鼠小肠黏膜黏蛋白，尤其是唾液黏蛋白的分泌，减轻洛索洛芬钠诱导的小肠黏膜损伤，并发现该保护机制可能与抑制肠道细菌过度生长有关，提示了替普瑞酮治疗肠道黏膜损伤、保护肠黏膜屏障功能的潜力。Niwa等［5］开展的前瞻性随机双盲安慰剂对照交叉试验证实替普瑞酮对NSAIDs相关性胃肠黏膜损伤具有保护作用，以胶囊内镜对胃肠黏膜损伤进行评估，发现替普瑞酮加雷贝拉唑与安慰剂加雷贝拉唑相比，能明显减轻双氯芬酸钠引起的胃和小肠黏膜损伤。基于上述研究结论，推测替普瑞酮对AP时的肠黏膜屏障损伤亦可能具有潜在保护作用。本研究结果显示，造模前后给予替普瑞酮灌胃干预的AP模型大鼠，血清促炎细胞因子 IL-1、IL-6、TNF-α 水平显著降低，提示替普瑞酮干预对AP时的全身性炎症反应有一定抑制作用，同时该组小肠黏膜组织病理学和超微结构病变明显减轻，血清淀粉酶水平显著下降，提示替普瑞酮能保护AP时的小肠黏膜完整性和超微结构，改善胰腺组织破坏和小肠黏膜损伤。蛋白质印迹法检测显示，替普瑞酮干预可增强AP大鼠模型小肠黏膜上皮细胞间紧密连接结构主要功能蛋白occludin、ZO-1表达，提示替普瑞酮可能通过上调紧密连接蛋白表达参与了AP时肠黏膜屏障的保护。该作用是否能进一步减轻胰腺组织学损伤，提高AP模型大鼠的生存率，尚有待进一步研究。

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