犬大脑中动脉近端栓塞建立类腔隙性脑梗死模型的研究

程期光 刘圣 许晓泉 祖庆泉 盛晔 余静 施海彬

·实验研究·

犬大脑中动脉近端栓塞建立类腔隙性脑梗死模型的研究

程期光 刘圣 许晓泉 祖庆泉 盛晔 余静 施海彬

目的 研究介入法血栓栓塞犬大脑中动脉（MCA）建立脑梗死模型的可行性、稳定性及急性期在磁共振扩散加权成像（DWI）上的演变过程，并探讨该模型的发生及其可能的发病机制。方法 成年健康毕格犬6只，插管至左侧颈内动脉后采用1条直径约1.7 mm、长5 mm的白色血栓栓塞，栓塞成功后30 min～6 h内每30 min使用DWI序列连续扫描观察梗死病灶急性期的演变过程。栓塞后24 h、7天复查血管造影、MR扫描及神经功能评分，记录梗死灶的出现时间、位置及大小，分别比较6 h DWI病灶、24 h和7天的T2加权像上病灶的体积，并比较24 h与7天的神经功能评分。7天后处死动物取脑组织行病理检查。结果 所有犬皆为左侧MCA的近端栓塞，DWI在栓塞后(1.24±0.51)h可以在基底节、脑白质区显示单一或数个异常信号病灶，6 h DWI病灶的直径为(6.90±2.08)mm。共有9个病灶在三个时间点都可以显示，病灶的大小均＜10 mm； 栓塞后6 h DWI，24 h T2WI以及7 d T2WI病灶体积分别为(168.39±138.11)mm3、(186.88±161.54)mm3和(165.89±135.30)mm3，三者之间差异无明显统计学意义（P=0.0531）。7 d时动物均存活，24 h和7 d的神经功能评分分别为4.50±1.38和2.33±0.82（P=0.0009）。病理学检查证实为基底节梗死最常见，其次为脑白质区。结论 介入单栓子栓塞法可以成功建立犬MCA近端栓塞的类腔隙性脑梗死模型，DWI能够在早期检测到小的脑缺血病灶。犬拥有丰富的颅内外血管吻合，近端大血管栓塞可形成类腔隙性脑梗死的病灶，因此栓塞可能是腔隙性脑梗死的病因之一。

动物实验； 血栓形成； 大脑中动脉； 脑梗死

腔隙性脑梗死约占所有脑缺血性发作性疾病的25%[1]。早期多认为颅内穿支动脉的病变（包括脂透明膜病、动脉粥样硬化等）是造成深部脑组织腔隙性梗死的主要原因。近期有学者发现在丰富的颅内外血管吻合存在的情况下，颅内大血管栓塞也可仅形成脑组织深部的小面积梗死[2-4]，但其确切的发生机制尚存在争议。

建立合适的实验动物模型是研究和验证疾病形成机制的重要手段，然而由于腔隙性脑梗死涉及颅内穿支动脉的特殊性，建立相应的模型相对困难；且常用的相关实验动物也存在一些不足：目前多用鼠作为实验动物，通过显微外科结扎动脉或非血栓栓塞建立梗死模型，但实验需要显微外科手术，操作难度大；且鼠与人脑组织差异较大，无法较好地模拟人发病时的情况[5]。

为进一步探讨腔隙性脑梗死的发病机制，本实验采用与人脑组织结构相似的毕格犬作为研究对象，通过介入自体血栓栓塞犬大脑中动脉（middle cerebral artery，MCA）近端，实验发现可以建立较稳定的类腔隙性脑梗死动物模型，同时利用DWI扫描动态监测腔隙性梗死灶的变化规律，为目前腔隙性脑梗死病因的理论假设提供了一定的实验依据。

材料与方法

一、实验动物

成年毕格犬6条（本校实验动物中心提供），雌雄不限，体重12～15 kg，3 ml/kg肌内注射戊巴比妥钠麻醉，维持犬体温在37～39℃左右。双侧股动脉、左侧股静脉穿刺置入5F导管鞘以监测血压、血气等指标及静脉给药。该实验方案经过我校伦理委员会批准后进行。

二、血栓制备

抽取犬自体静脉血10 ml，以4000 r/min离心10 min。取上层血浆约4.0 ml，加入1.0 ml含250 U凝血酶的生理盐水中，混匀后立即注入8F截断的导引导管中（内径约2.5 mm，长约20 cm）。室温下放置2 h后将凝固及水分析出的线样血栓从导管中取出，置入生理盐水中反复漂洗，再用吸水纱布吸干血栓表面水分，此时血栓直径约为1.7 mm，然后将血栓剪成长为5 mm的血栓条备用。

三、模型建立

经右侧股动脉鞘引入5F椎动脉导管，分别插管至双侧椎动脉、颈外动脉及颈内动脉行血管造影，后插管至左颈内动脉上升支内约2 cm处，手推对比剂并确认无明显反流后，用装有生理盐水的10 ml注射器吸取1枚血栓注入导管，血栓注入后换装有2 ml造影剂注射器缓慢推入，当大脑前动脉显影时说明血栓进入了大脑中动脉（middle cerebral artery, MCA）并进行血管造影证实，栓塞后分别于6 h、24 h、7 d造影以观察血管的再通情况。栓塞操作通常需耗时约20 min，模型建立后实验动物立即被转运至MR检查室行MR扫描。

四、栓塞后评估

1.MR评估：MR扫描采用3.0T 磁共振扫描仪（Magnetom Trio，西门子），直径15 cm的膝关节扫描线圈，于栓塞完成后30 min开始进行。扫描序列及参数包括：①T1加权成像参数：TR 1390 ms，TE 11 ms，包括22 层，2 mm 层厚，20 cm视野，矩阵320×320；②T2加权成像参数：TR 5000 ms，TE 66 ms，包括22层，2 mm 层厚，20 cm视野，矩阵320×320；③扩散加权成像（diffusion weighted imaging，DWI）参数：TR 5500 ms，TE 97.3 ms，2 mm层厚，22 cm视野，矩阵192×192，b值50及800 s/mm2。6 h以内间隔30 min重复扫描一次，栓塞后24 h及第7天时采用同样参数复查。两个独立观察者采用Image J软件通过栓塞后6 h的DWI及栓塞后24 h、7 d的T2WI图像测量犬脑梗死灶的体积。

本实验结合文献报道及犬的脑组织体积[5-6]将犬的腔隙性脑梗死定义为MR图像包括DWI、T2WI及经TTC染色后的脑组织病理标本上位于基底节、脑干或脑白质区的圆形或卵圆形的缺血性病灶，最大直径≤10 mm。

2.神经功能评分：本实验神经功能评分采用国际上通行的犬的神经功能评分方法[7]。评分项目包括：①运动功能（无异常=1，轻偏瘫但能行走=2，辅助下能站立=3，重偏瘫不能站立、昏迷、死亡或无法测试=4）；②意识状态（正常=1，轻度减弱=2，严重影响=3，昏迷或死亡=4）；③头旋转（无=0，强迫转向病侧或更加严重的状态=1）；④转圈（无=0，出现=1，无法运动或死亡=1）；⑤偏盲（无=0，出现或更加严重的状态=1）。每条犬分别在麻醉前、栓塞后24 h及栓塞后第7天由两位观察者独立评分并取平均值。

3.病理检查：栓塞后第7天静脉注射过量戊巴比妥（80 mg/kg）处死实验动物，完整地取出脑组织置入冰水中固定10 min，后制成层厚约2 mm的冠状切片，避光环境下置入浓度为2 %的TTC溶液（37℃）中染色30 min。将完成染色的切片置入4%甲醛液中固定72 h，HE染色后光镜下观察。

五、数据分析

结 果

一、血管造影

血管造影可以清晰显示毕格犬的脑血管解剖结构。采用单血栓栓塞，每只犬的左侧MCA近端主干均被成功栓塞，同侧的颈内动脉、大脑前动脉以及大脑后动脉均能正常显影。通过同侧的大脑前动脉和大脑后动脉的皮质支与终末的软脑膜之间的吻合，左侧MCA远端（皮质支）在栓塞后造影的动脉晚期也可显影。栓塞后24 h，所有6只实验犬的左侧MCA均没有出现血管再通。栓塞后7 d时复查血管造影发现闭塞的MCA部分或全部再通（图1）。

图1 毕格犬栓塞前后脑血管的DSA图像 颅内造影示动脉显影清晰，A.栓塞前造影所示左侧MCA（箭）；B.栓塞后左侧MCA近端未见显示，动脉晚期同侧远端皮层动脉通过侧支循环显影；C.栓塞后7 d复查DSA证实血管基本再通

二、MR成像

栓塞后6 h内T2WI图像均未观察到异常信号变化，但DWI图像上较早出现了高信号灶，且梗死发生时间越长，病灶信号强度越高，边界越清晰（图2）。大部分（4例）图像仅出现单发病灶，均分布于左侧尾状核区域，1例（dog4）出现两处病灶，分别位于左侧尾状核及左侧内囊，1例（dog5）发现了4处高信号灶，分别位于左侧尾状核、内囊、丘脑旁白质及皮质，该皮质区病灶于栓塞后5.5 h才被观察到，且栓塞后第7 d的MR扫描及大体标本上均未再次见到，因此本实验中统计时将此数据剔除。这样对术后6 h内DWI共检测出的9处病灶进行了统计分析，平均检出时间为(1.24±0.51)h，术后6 h DWI病灶直径平均为(6.90±2.08) mm；栓塞后6 h DWI病灶的最大径均＜10 mm，符合我们文中腔隙性梗死的定义。栓塞后6 h、24 h以及7 d三个时间点分别测得梗死灶体积为(168.39±138.11)mm3，(186.88±161.54) mm3及(165.89±135.30)mm3。7 d时梗死灶体积较24 h呈缩小趋势，但三者体积间差异无统计学意义（P=0.0531，表1）。

图2 连续的DWI和T2WI冠状位扫描图像 分别采自栓塞后1 h（A）、2 h（B）、6 h（C）、24 h（D）以及7 d（E）。栓塞后1 h左侧基底节区DWI上观察到高信号灶（A），随着时间进行，DWI信号逐渐增高，栓塞后7 d病灶信号有减小、减低趋势。6 h内T2WI均未检出异常信号灶（A～C），24 h以及7 d可以观察到相应区域T2WI高信号

表1 栓塞后MR成像评估及神经功能评分

三、神经功能评分

栓塞后24 h时动物苏醒后进行神经功能评估：6条实验犬中有5例表现出神经功能障碍，其中4例表现为右侧肢体轻度偏瘫，但能正常行走，另外1例表现为颈部向对侧偏斜，1例仅在栓塞后24 h的DWI上示左侧尾状核出现孤立小病灶（直径3.5 mm）的犬（dog2）未表现出任何可以观察到的行为异常。栓塞7 d后所有动物均存活，动物的神经功能障碍也基本正常，6例中仅有1例残留右侧肢体轻偏瘫及颈部向对侧偏斜。术后24 h及7 d时平均神经功能评分分别为4.50±1.38和2.33±0.82，前者高于后者（t=7.0502，P=0.0009）。MR扫描数据及对应神经功能评分见表1。

四、病理结果

所有犬脑组织标本均未见明显脑组织肿胀以及出血，并可在肉眼下于栓塞侧深部脑实质观察到梗死灶，多位于左侧尾状核，少数分布在内囊和脑白质，与MR扫描结果一致。梗死灶直径约3～8 mm不等，中央呈灰白色（图3A），光镜下可见梗死区周围脑组织轻度水肿，神经细胞发生凝固性坏死，细胞轮廓模糊，神经细胞和胶质细胞明显减少甚至消失，部分区域见中性粒细胞浸润，小胶质细胞增生吞噬，梗死灶和正常区之间有明显的分界，由内向外分别为梗死区、水肿带及正常区（图3B）。

图3 左侧基底节区梗死灶冠状位脑组织标本及病理 A.TTC染色后左侧基底节区见直径约4.5 mm大小未染区域；B.光镜下见梗死区与正常区之间分界明显，神经细胞数目明显减少，凝固性坏死及核裂解（HE，×100）

讨 论

本研究通过介入插管及血栓栓塞的方法成功建立了犬MCA近端栓塞的脑梗死动物模型，该模型的制作具有操作简便、动物的选择及发病与人类更加相似、创伤小而动物易存活等优点，并且第一次对类腔隙性脑梗死的小病灶在MR上的演变过程进行了研究。实验结果证实在脑侧支循环丰富的动物其近端大血管栓塞可以造成近似于人类腔隙性脑梗死的病灶，由此我们推测在人类存在MCA等大血管狭窄并建立了相对丰富的颅内外侧枝循环的基础上，其血管的近端栓塞可能会仅造成腔隙性脑梗死表现。该动物模型不仅能够为临床现象提供一定的实验性证据，而且可能为临床上针对腔隙性脑梗死的个体化治疗甚至溶栓治疗提供依据，从而改善其预后和提高疗效[1-4,8]。

因为容易获得，价格经济，与人体解剖结构相近及脑血管变异小等优点，本研究选择了毕格犬作为实验动物建立脑梗死模型。但是由于毕格犬的颈内动脉扭曲而难以进行选择性插管，加上其颈内外动脉之间侧支循环相对丰富以及血栓偶有碎裂等原因，建立稳定的梗死模型是本实验的难点。我们在预实验中发现毕格犬MCA的M1段长度约13 mm，直径约1.0 mm，且有文献指出长约5 mm，直径约1.66 mm的栓子较易进入到MCA[9-10]，因此该研究制作的自体白色血栓长为5 mm，直径1.7 mm。这种改良后的栓子稳定，弹性好，易于注射，而且实验中证实经颈内动脉注射时全部栓塞近端MCA的同时不影响周围的动脉。我们分析认为可能主要是因为①MCA是颈内动脉的延续，血栓注入时会自然进入该血管；②犬大脑前动脉的管径相对较小，选择较大直径的血栓无法进入其开口[10]。本研究结果显示大多数犬的梗死灶出现于尾状核区域，分析原因可能是这些区域主要由豆纹动脉等深部穿支动脉等供血，这些动脉大多从MCA近端发出，注入的血栓阻挡了脑深部穿支动脉的开口，导致的局部梗死灶的形成。而MCA远端由于建立末梢侧支循环而血流不受明显影响，因此并未出现梗死灶。6只犬中有4只犬脑组织内仅出现单发病灶，2只犬出现多发梗死灶，分析可能与深部穿支动脉的位置与数目变异相关[5,11]。

近年来，功能性影像学检查如CT灌注成像、DWI、灌注加权成像（perfusion weighted imaging，PWI）等特殊成像方法在脑梗死的早期诊断和治疗过程中发挥了巨大的作用[12-14]。既往文献报道DWI在脑梗死发病数分钟内就可以显示出信号异常，也有研究认为DWI显示病灶的时间与病灶的大小、部位等因素相关[4,13]。但因为腔隙性脑梗死的临床症状相对轻，甚至大部分患者表现为隐匿性梗死从而在临床上被忽视，因此临床上对这种小病灶急性期DWI图像特点及其演变过程的经验仍不足。本实验中在栓塞后30 min开始进行DWI扫描，多数病灶平均1 h左右可以被检出，经分析梗死灶的大小与检出时间并无明确的统计学相关性。在6 h时（超急性期）所有犬DWI图像上都可以明确病灶的大小和部位，因此初次测量梗死体积时采用的是6 h时DWI图像。24 h及7 d的T2WI图像上所显示的梗死灶的位置与6 h的DWI图像相一致。本实验中24 h较6 h梗死体积有增大趋势，有研究证明急性梗死灶在急性期随着时间进行性增大，约于70 h达到最大值，考虑由于异常灌注影响梗死周围缺血组织不断地向梗死方向发展从而导致梗死体积增大，同时梗死局部组织急性期水肿也是影响体积变化的因素；梗死体积稳定后随时间进行逐渐缩小，分析可能和血管部分再通以及侧支循环建立促进水肿、坏死组织的吸收有关[6,8,15]，印证了本研究中7d时梗死灶的范围相对于前面的时间点呈现出缩小的趋势，这与神经功能评分的结果也相一致。

本研究也存在一些不足之处，首先在于实验动物数量相对较少，并且没有进行长期的随访研究；另外，为精确地研究DWI的动态变化过程，本研究的MR扫描时间间隔为30 min，没有能够进行PWI检查并探讨DWI与PWI的匹配情况等，这些都需要今后的实验中进一步完善。

总之，本研究通过自体血栓及血管介入栓塞等技术，栓塞毕格犬的MCA近端建立了类似于人类腔隙性脑梗死的动物模型，并由此推测血栓栓塞可能是腔隙性脑梗死的病因之一。DWI扫描可以在发病早期检测病灶，在一定范围内病灶大小与显示时间没有明确的相关性，随着时间的延长病变的显示更加清晰，DWI信号异常的部位、大小与最后的梗死灶有很好的匹配性。

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Canine embolic stroke model resembling lacunar infarction following proximal cerebral artery occlusion

Cheng Qiguang, Liu Sheng, Xu Xiaoquan, Zu Qingquan, Sheng Ye, Yu Jing, Shi Haibin. Radiology Department, the First Affliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China

Liu Sheng, Email: liusheng1137@sina.com

Objective To evaluate the feasibility, stability and process on diffusion weighted imaging (DWI) in acute phase of a middle cerebral artery (MCA) embolic occlusion stroke model in beagle dogs, and to discuss the potential mechanisms of lacunar infarction. Methods Six adult beagle dogs were involved in this study. After the catheterization was manipulated into the left internal carotid artery, an autologous clot about 1.7 mm in diameter and 5 mm long was injected through the catheter in each dog. The DWI was performed to evaluate the progression of ischemic lesions at 30 min interval within 6 h after embolization. The MR examinations with the same parameters and neurobehavioral scoring were performed at 24 h and 7 days after procedure. These animals were sacrifced for pathological examination at 7 days after embolization. Results The left proximal MCA ware successfully occluded in all dogs using single-thrombus method. The solitary or multiple ischemic lesions shown as high signal intensity on DWI were observed with the mean detecting time of (1.22±0.51)h in the deep brain area, and the mean diameter of induced infarctions was (6.90±2.08)mm on 6 h-DWI after embolization. The mean volume of these lesions was (168.39±138.11)mm3, (186.88±161.54)mm3 and (165.89±135.30)mm3 at 6 h on DWI, 24 h and 7 days on T2 image, respectively. The statistical analysis didn’t show significant difference in the volume among the three time points (P=0.0531). The neuro-behavioral scores were 4.50±1.38 at 24 h and 2.33±0.82 at 7 days after procedure (P=0.0009). The ischemic infarctions located in the basilar ganglion area were most frequent in pathological examination. Conclusions The DWI abnormalities resembling lacunar infarcts can be detected in early phase after reliable proximalMCA occlusion using thrombi in beagle dogs, which exist abundant collateral anastomosis between the ECA and ICA. Our results provide further support for the concept that emboli may be a potential cause of lacunar infarcts.

Animal experimentation； Thrombosis； Middle cerebral artery； Cerebral infarction

2014-8-14）

（本文编辑：黄强）

10.3877/cma.j.issn.2095-5782.2015.01.009

210029 南京医科大学第一附属医院放射科（程期光、刘圣、许晓泉、祖庆泉、盛晔、余静、施海彬）

刘圣，Email：liusheng1137@sina.com