高效液相色谱法测定血清碘海醇浓度方法的建立和应用

王宝宝，武元，付 强，弓孟春，石希敏，景红丽，李 方，陈朝英，宋红梅，秦 岩*，李雪梅

(中国医学科学院 北京协和医院1.肾内科;2.药剂科;3.核医学科;5.儿科，北京100730;4.首都儿科研究所附属儿童医院 肾内科，北京100020)

肾小球滤过率(glomerular filtration rate，GFR)是评价肾脏功能的最佳指标。以内源性标志物为基础的eGFR(estimated glomerular filtration rate，eGFR)预测公式为临床广泛应用。然而，国内儿童eGFR公式多是采用国外公式[1-2]，其在中国儿童中的适用性并未得到广泛认可。碘海醇血浆清除率因操作方法简便、无放射性，与菊粉及放射性标志物(如99mTc-DTPA和51Cr-EDTA 等)清除率具有较好的一致性，在国外被用来评估包括儿童在内的广泛人群的GFR[3-5]。而且，其用于评估肾功能时所用剂量约为5 mL，为常规造影剂量的1/20，安全性非常好[2，6]。但是，国内关于碘海醇浓度测定方法的研究较少，使得碘海醇清除率尚未推广。本研究拟建立测定血清碘海醇浓度的HPLC 法，并探索碘海醇清除率在慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)儿童肾功能评价方面的可行性。

1 材料与方法

1.1 患者一般资料

33例CKD 患儿中，男13例，女20例，平均年龄(11.8±2.5)岁，身高(148.4±15.7)cm，体质量(45.5±18.0)kg，血清肌酐为(59.42±21.31)μmol/L(酶法)。33例患儿以99mTc-DTPA血浆清除率为CKD分期标准分为:1期13例，2期15例，3期5例。

该研究通过北京协和医院伦理委员会的审查。所有患儿接受检查前均由监护人签署知情同意书。

1.2 HPLC方法建立

1.2.1 试剂:碘海醇标准品(98%，Sigma 公司)。内标(internal standard，IS):碘海醇杂质B(100%，中国药品生物制品检定所)。

1.2.2 色谱条件:色谱柱(日本岛津CLC-ODS，150 mm×6.0 mm，5 μm)，流动相为乙腈与超纯水3∶97体积配制(磷酸调节pH至3.0～3.5)，检测波长(λ)254 nm，柱温40℃，流动相流速1.2 mL/min。

1.2.3 溶液配制:1)碘海醇标准母液(10 g/L)。2)内标为碘海醇杂质B 溶液(1 g/L)。3)血清标准曲线(10～1 000 mg/L，n=7):将碘海醇标准母液分别以空白血清稀释，配制血清标准曲线系列，浓度分别为1 000、500、250、100、50、25 和10 mg/L。4)血清质控样本(低、中和高浓度):将碘海醇标准母液以空白血清稀释成20、200 和750 mg/L 质控样本。用于方法学批间(n =6)、批内(n =10)及回收率变异性考察。

1.2.4 样本体系配制:取100 μL 样本(标准曲线样本或质控样本)加入20 μL 内标液，再加入100 μL高氯酸(5%)，沉淀离心后取10 μL 上清液进样分析。

1.2.5 方法学验证:包括线性关系考察、精密度、真实性考察及药物干扰性试验。

1.3 HPLC 法用于碘海醇血浆清除率的测定

1.3.1 受试对象:纳入2013年4月至2014年2月在北京协和医院和首都儿童研究所就诊的CKD 儿童33例。排除如下情况:急性肾损伤，严重浮肿，明确的全身性感染，恶性肿瘤病史，近期重大手术病史及无法配合检查者。所有患儿采用最新Schwartz 公式估算eGFR[2]，并同时进行99mTc-DTPA血浆清除率及碘海醇血浆清除率测定。

1.3.2 碘海醇和99mTc-DTPA血浆清除率测定:检查日，鼓励患儿多饮水、多排尿。在一侧上肢静脉注射5 mL 碘海醇(欧乃派克300，通用公司)后，于2和5 h在对侧静脉取血，于血清管中离心，采用HPLC方法测定碘海醇浓度。碘海醇清除率计算公式[7]为GFR(mL/min)=Q0/(c1/b)。其中，碘海醇血清浓度分别记为C(2 h)和C(5 h)。以[ln C(2 h)，120 min]和[ln C(5 h)，300min]两点描记一条直线。c1代表此直线截距所对应的碘海醇浓度值，而b代表其斜率。Q0为注射碘海醇总量。

在另一侧上肢“弹丸式”注射99mTc-DTPA后，于2和4 h 对侧取血，肝素抗凝，离心后取血浆1 mL，用于测定血浆中99mTc-DTPA 放射性粒子数。双血浆法99mTc-DTPA清除率计算公式[8]为GFR (mL/min)={[Dln (C1/C2)]/(T2-T1)}exp {[(T1lnC2)-(T2lnC1)]/(T2-T1)}。其中:D 为注入药物的放射性计数;T1、T2分别为注入放射性药物至第1次和第2次采血时间(min)，C1、C2分别为T1和T2时血浆中放射性计数。

两种方法的血浆清除率均采用儿童Brochner-Mortensen 公式[9]进行单室模型校正和Haycock's 公式进行体表面积(BSA)校正。

1.4 统计学分析

应用SPSS 17.0 和MedCalc 11.1.1.0 进行数据分析。采用Pearson 相关性系数判断两种方法之间的相关性;使用偏倚、Bland-Altman 分析判断两种方法的一致性;使用研究方法测定GFR位于参照方法GFR±15%和±30%区间的比例判断GFR 预测的准确性。数据用均数±标准差(±s)表示。数据比较采用配对t 检验。

2 结果

2.1 HPLC方法建立与验证

2.1.1 色谱行为:在设定的色谱条件下，空白血清色谱图可见血清杂峰多集中在5 min 之前，之后基线平坦(图1)。血清中加入碘海醇和内标后，可见碘海醇及内标峰位处背景干净，无杂峰干扰，二者可达基线分离。碘海醇以两种异构体的形式同时存在，其洗脱时间分别为10.17 和11.38 min。内标洗脱时间为8.91 min。(图2)。

图1 空白血清的色谱图Fig1 HPLC chromatogram of blank serum

图2 血清中加入内标和碘海醇的色谱图Fig2 HPLC chromatogram of internal standard (IS)and iohexol (The concentration of IS and iohexol was 1 g/L and 200 mg/L respectively)

2.1.2 方法学验证:通过计算碘海醇和内标的峰高比(peak height ratio，PHR)，由峰高比对标示浓度(C)进行线性回归，得回归方程Y = 3.1368X+0.0034(R2=0.9998)，说明碘海醇血清浓度在10～1 000 mg/L 范围内线性良好(图3)。批间测量(n=6)和批内测量(n=10)的相对标准偏差(RSD%)均控制在5%以下，回收率(R%)达96%以上(表1)。将3个质控样本在室温自然光下放置12 h，其浓度RSD%均＜2%。两个标准曲线点在-60℃和室温下反复冻融6次后，其浓度RSD%同样＜2%。此外，对正在使用包括降压药、糖皮质激素类、免疫抑制剂、抗生素类等30 余种临床常用药物的患者血清进行HPLC 分析，在碘海醇和内标峰位处均未发现干扰峰的存在。

图3 碘海醇和内标的峰高比(PHR)对碘海醇浓度(C)进行线性回归Fig3 The linear regression between peak height ratio of iohexol to internal standard (IS)and the concentration of iohexol

表1 HPLC 法测定血清碘海醇的方法学验证Table1 The validation of HPLC method for measurement of serum iohexol concentration

2.2 碘海醇血浆清除、eGFR 与99mTc-DTPA血浆清除率比较

碘海醇血浆清除率、eGFR 分别与99mTc-DTPA血浆清除率进行相关分析，相关系数(r)分别为0.95(P＜0.05)(图4)与0.63(P＜0.05)(图5)。Bland-Altman 一致性分析显示碘海醇血浆清除率与99mTc-DTPA血浆清除率的差值为(6.24±10.81)mL/(min·1.73 m2)，最大差值的绝对值为32.62 mL/(min·1.73 m2)(图6A);eGFR 与99mTc-DTPA血浆清除率的差值为(12.11±22.96)mL/(min·1.73 m2)(图6B)，最大差值的绝对值为74.76 mL/(min·1.73 m2)。碘海醇血浆清除率、eGFR位于99mTc-DTPA血浆清除率±15%范围内比例分别为75.76%和45.45%;±30%范围内比例分别为97.06%和75.76%。因此，碘海醇血浆清除率与99mTc-DTPA血浆清除率具有更好的相关性和一致性。

图4 碘海醇清除率与99mTc-DTPA 清除率的相关性分析Fig4 The correlation between iohexol plasma clearance and 99mTc-DTPA clearance

图5 eGFR 与99mTc-DTPA 清除率的相关性分析Fig5 The correlation between eGFR by formula and99mTc-DTPA clearance

图6 碘海醇清除率、eGFR 与99mTc-DTPA 清除率的bland-altman 分析Fig6 The bland-altman analysis of two methods

3 讨论

碘海醇血浆清除率用于评价GFR 具有准确性好、操作方法简便、安全、无放射性等优点。而血清碘海醇浓度的准确测定是该方法应用的前提。以往，碘海醇浓度测定多采用X-ray 荧光法[5，10]，但这种方法在碘海醇浓度较低时准确性变差，碘海醇用量需10～50 mL，这可能会损害部分患者肾功能。而HPLC 法灵敏度较高，碘海醇用量仅约5 mL，在用这种低剂量碘海醇评估肾功能的研究中均未发现严重不良反应事件[6，11]。本研究建立了血清碘海醇浓度测定的HPLC 法，碘海醇血清标准曲线位于较广区间内，且线性良好。对碘海醇样本进行放置和冻融稳定性的研究结果显示，碘海醇样本本身性质稳定，不易被降解，这与文献报道[12]一致。另外，药物干扰性试验表明临床常用药物不会对HPLC 法测定碘海醇浓度造成干扰。

使用血清生化指标估算GFR (eGFR)一直以来都是肾内科学术领域研究的热点[13-14]。以血清肌酐为基础的儿童Schwartz 公式仍是临床最常用的预测公式。但是，国内尚无使用外源性标志物血浆清除率法进行儿童GFR的研究，因而，基于西方儿童而研发的eGFR 公式在中国儿童中的适用性并不明确。本研究结果表明通过最新Schwartz 公式计算得eGFR 与双血浆99mTc-DTPA 清除率的差异明显高于碘海醇血浆清除率与该标准的差异。

综上所述，本研究建立了利用HPLC 法测定血清碘海醇浓度的方法，该法稳定、可靠，为使用碘海醇测定GFR的推广解决了技术性问题;并初步探索了碘海醇清除率用于CKD 儿童肾功能评价的可行性。今后将扩大CKD 各个分期的患儿样本例数，进一步完善碘海醇血浆清除率在中国CKD 儿童肾功能评价方面的应用，并对国际上的eGFR 预测公式进行验证，以期建立适合中国儿童的eGFR 公式。

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