法舒地尔抑制Ang Ⅱ诱导的大鼠心肌成纤维细胞增殖

郭冰冰，路 明，李文杰

(徐州医学院附属医院 儿科，江苏 徐州221000)

心肌纤维化(myocardial fibrosis，MF)主要由心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts，CFb)的过度增殖、大量合成和分泌基质蛋白及胶原纤维所致。近来发现RhoA/ROCK信号通路与多种心血管疾病，如慢性心力衰竭、高血压和动脉粥样硬化等密切相关[1]，但其在CFb 增殖及心肌纤维化中的作用还缺乏深入研究。法舒地尔(Fasudil，Fas)是唯一应用于临床的Rho 激酶特异抑制剂，临床发现其可改善高血压及心力衰竭患者的心功能。本实验应用血管紧张素Ⅱ(angiotensin，Ang Ⅱ)诱导大鼠CFb的增殖及胶原合成，模拟心肌纤维化的病理过程，探讨Fas 抑制心肌纤维化的可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂:清洁级1～3 d的SD大鼠[徐州医学院实验动物中心，SCXK(苏)2013-003]。Ang Ⅱ、四甲基偶氮唑盐(MTT)(Sigma 公司);DMEM 培养基、胎牛血清(Gibco 公司);兔抗大鼠波形蛋白单克隆抗体(武汉博奥森公司);羟脯氨酸试剂盒(南京建成公司);结缔组织生长因子(CTGF)一抗、总RNA 提取试剂(Trizol)和反转录试剂盒(Invitrogen公司);法舒地尔注射液(天津红日药业有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 CFb的培养与鉴定:采用胰蛋白酶消化法及差速贴壁法培养CFb，置显微镜观察细胞形态，免疫荧光波形蛋白染色鉴定CFb。

1.2.2 实验分组:细胞随机分为5 组:1)对照组;2)Ang Ⅱ组:AngⅡ1×10－6mol/L;3)AngⅡ+Fas 低剂量(25 μmol/L);4)Ang Ⅱ+Fas 中剂量组(50 μmol/L);5)Ang Ⅱ+Fas 高剂量组(100 μmol/L)。

1.2.3 MTT 比色法检测细胞增殖:按照MTT 比色法步骤进行操作。

1.2.4 羟脯氨酸法检测CFb 胶原含量:严格按照羟脯氨酸试剂盒说明书进行操作。

1.2.5 RT-PCR检测RhoA 及ROCK mRNA:常规提取细胞总RNA 和反转录，定量PCR扩增目的基因。

1.2.6 Western blot检测CTGF蛋白水平:三去污法提取总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，凝胶图像分析系统检测蛋白条带的吸光度值。

1.3 统计学分析:所有数据采用SPSS16.0 统计学软件进行处理，计量资料以均数±标准差(±s)表示，多组均数间比较应用One-way ANOVA 分析。

2 结果

2.1 心肌成纤维细胞的鉴定:CFb 呈梭形或不规则三角形，细胞核较大呈椭圆形，胞质透明，抗波形蛋白单克隆抗体免疫荧光染色为阳性(图1)。

图1 CFb的细胞鉴定图Fig1 The identification of CFb cells

2.2 不同浓度Fas 对Ang Ⅱ诱导的CFb 增殖和胶原合成的影响:Ang Ⅱ组细胞增殖及胶原合成量显著高于对照组(P＜0.05)，而Fas 中、高剂量干预组使其明显下降(P＜0.05)(表1)。

2.3 Fas 对Ang Ⅱ诱导的CFb 中RhoA 及ROCK mRNA表达的影响:Ang Ⅱ组RhoA 及ROCK mRNA表达量显著高于对照组(P＜0.01)，而Fas 中、高剂量干预组使其明显下降(P＜0.01)(图2，表2)。

表1 不同浓度Fas 和1×10 －6 mol/L Ang Ⅱ对CFb的增殖及胶原合成的影响Table1 Effects of Fas and 1×10 －6 mol/L Ang Ⅱon the proliferation and collagen synthesis of CFb(±s，n=6)

表1 不同浓度Fas 和1×10 －6 mol/L Ang Ⅱ对CFb的增殖及胶原合成的影响Table1 Effects of Fas and 1×10 －6 mol/L Ang Ⅱon the proliferation and collagen synthesis of CFb(±s，n=6)

*P＜0.01 compared with control group;#P＜0.05，##P＜0.01 compared with Ang Ⅱgroup.

group A value collagen synthesis control 0.29±0.02 1.38±0.13 Ang Ⅱ 0.38±0.02* 1.79±0.10*Fas 25 μmol/L+Ang Ⅱ 0.36±0.03 1.65±0.11 Fas 50 μmol/L+Ang Ⅱ 0.35±0.02# 1.56±0.10##Fas 100 μmol/L+Ang Ⅱ 0.33±0.01## 1.52±0.09##

图2 各组心肌成纤维细胞RhoA 和ROCK mRNA的表达Fig2 The expression of RhoA and ROCK mRNA in different groups

2.4 Fas 对Ang Ⅱ诱导的CFb 中CTGF蛋白表达的影响:Ang Ⅱ组CTGF蛋白表达显著高于对照组(P＜0.01)，而Fas中、高剂量干预组使其明显下调(P＜0.01)(图3，表2)。

表2 各组心肌成纤维细胞RhoA、ROCK mRNA 和CTGF蛋白的表达Table2 Expression of RhoA，ROCK mRNA and CTGF protein in different groups (±s，n=6)

表2 各组心肌成纤维细胞RhoA、ROCK mRNA 和CTGF蛋白的表达Table2 Expression of RhoA，ROCK mRNA and CTGF protein in different groups (±s，n=6)

*P＜0.01 compared with control group;#P＜0.05 compared with AngⅡgroup.

group ROCK mRNA RhoA mRNA CTGF protein control 0.46±0.07 0.37±0.12 0.53±0.10 Ang Ⅱ 1.53±0.12* 1.28±0.10 1.49±0.16*Fas 25 μmol/L+Ang Ⅱ 1.47±0.09 1.12±0.06 1.36±0.16 Fas 50 μmol/L+Ang Ⅱ 0.85±0.10# 0.68±0.09b 0.77±0.08#Fas 100 μmol/L+Ang Ⅱ 0.69±0.08# 0.57±0.08b 0.65±0.10#

图3 各组心肌成纤维细胞CTGF的蛋白表达量Fig3 The expression of CTGF protein in different groups

3 讨论

CFb是心肌纤维化的主要效应细胞，Ang Ⅱ诱导CFb 增殖的作用已得到公认[2]。Fas是Rho 激酶特异抑制剂，其逆转心肌纤维化的具体机制尚不明确。

研究发现，RhoA/ROCK 通路参与调控心肌肥大及CFb增殖凋亡，并在肝、肾、肺等脏器的慢性纤维化中异常活化和表达。结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)是体内最重要的促纤维化细胞因子TGF-β的直接下游效应介质，具有促进细胞增殖及细胞外基质沉积等多种生物学效应。Rho 激酶作为一个分子开关对TGF-β/ CTGF 基因调控起关键作用[3]。本实验发现Ang Ⅱ作用于CFb后，Rho/ROCK 通路被活化，继而CTGF表达上调。当Rho/ROCK 通路被Fas 特异性阻断后，CTGF的表达明显减少，CFb 增殖及胶原合成受到抑制。

综上所述，Fas 可通过抑制RhoA/ROCK 通路及其下游CTGF的表达抑制CFb的增殖，并在一定的范围内呈剂量依赖性。

[1]Parajuli N，Ramprasath T，Patel VB，et al.Targeting angiotensin-converting enzyme 2 as a new therapeutic target for cardiovascular diseases[J].Can J Physiol Pharmacol，2014，92:558-565.

[2]Tokuyama H，Wakino S，Hara Y，et al.Role of mineralocorticoid receptor/Rho/Rho-kinase pathway in obesity-related renal injury[J].Int J Obesity，2012，36:1062-1071.

[3]Sakai K，Jawaid S，Sasaki T，et al.Transforming growth factor-beta-independent role of connective tissue growth factor in the development of liver fibrosis[J].Am J Patholv，2014，184:2611-2617.