二甲基鞘氨醇抑制人RA-FLS增殖及IL-6和IL-8的分泌

袁红霞，邱振宇，周 盾

(辽宁医学院1.护理学院;2.附属第一医院 感染科;3.附属第一医院 高压氧科，辽宁 锦州121001)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性炎性反应疾病，迄今病因及机制仍不清楚。成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)具有类肿瘤细胞特性，在RA 发病中备受关注。二甲基鞘氨醇(N，N-dimethyl-D-erythro-sphingosine，DMS))是鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1，SPHK1)的特异性抑制剂，能有效抑制SPHK1 活性，参与RA的发病[1]。本研究观察DMS 对人RA-FLS增殖及分泌IL-6和IL-8的影响及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料:DMEM 高糖培养基、胎牛血清和胰蛋白酶(Hyclone 公司);WST-1 细胞增殖检测试剂盒和结晶紫(碧云天生物技术研究所);抗SPHK1 多克隆抗体(Abgent 公司);白介素-6和白介素-8 ELISA 试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 人RA-FLS 培养及活性检测:人RA-FLS(Cell Applications 公司)用含10% 胎牛血清的DMEM 高糖培养液于37℃、5% CO2条件培养，接种于96 孔(约2 000个/孔)，对照组不加DMS，实验组分别加5、10、15 和20 μmol/L DMS，24、48 和72 h后按WST-1 试剂盒说明书检测各组细胞的增殖活性。

1.2.2 结晶紫染色:各组细胞培养48 h后，用4%多聚甲醛固定15 min，结晶紫染色10 min，倒置显微镜观察细胞形态并拍照。

1.2.3 Western blot检测SPHK1蛋白的表达:按说明书检测对照组及DMS(10 μmol/L)组SPHK1蛋白。

1.2.4 ELISA 检测IL-6和IL-8的分泌:按说明书检测DMS(10 μmol/L)组RA-FLS 上清液中不同时间点(24、48 和72 h)IL-6和IL-8的分泌水平。

1.3 统计学分析:采用Graphpad Prism 5.0 进行作图和分析。实验数据以均数±标准差(±s)表示，两组之间计量资料的比较采用t 检验，多组之间计量资料的比较采用Oneway ANVOVA法。

2 结果

2.1 DMS 呈时间剂量依赖性抑制人RA-FLS的增殖(表1)。

表1 DMS 抑制人RA-FLS增殖Table1 DMS inhibits RA-FLS proliferation(±s，A value，n=6)

表1 DMS 抑制人RA-FLS增殖Table1 DMS inhibits RA-FLS proliferation(±s，A value，n=6)

＊P＜0.05 compared with control group.

group time/hours 24 48 72 control 1.65±0.28 1.72±0.12 1.67±0.05 DMS 5 μmol/L 1.50±0.16 1.45±0.09* 1.31±0.04*DMS 10 μmol/L 1.17±0.18* 1.02±0.18* 0.39±0.01*DMS 15 μmol/L 1.01±0.15* 0.63±0.08* 0.40±0.01*DMS 20 μmol/L 0.71±0.18* 0.47±0.05* 0.37±0.01*

2.2 DMS 影响人RA-FLS的形态:5、10、15 和20 μmol/L DMS 作用48 h后，细胞由长梭形变成不规则形，细胞密度明显降低，个别核出现固缩，胞质中有空泡(图1)。

2.3 DMS(10 μmol/L)抑制SPHK1蛋白表达:48 h后，DMS组SPHK1蛋白水平为0.41±0.19，明显低于对照组的1.01±0.19(n=3)(P＜0.05)(图2)。

2.4 DMS(10 μmol/L)抑制IL-6和IL-8 分泌:与24 h 相比，72 h IL-6和IL-8 分泌减少，(P＜0.05);与48 h 比较，72 h时IL-8 分泌减少(P＜0.05)(表2)。

图1 DMS 对人RA-FLS 形态的影响Fig1 Morphological alteration of RA-FLS following treatment with DMS(×200)

图2 DMS 抑制SPHK1蛋白表达Fig2 DMS inhibits SPHK1 expression

表2 DMS 抑制IL-6和IL-8 分泌Table2 DMS inhibits the secretion of IL-6/8(±s，pg/mL，n=3)

表2 DMS 抑制IL-6和IL-8 分泌Table2 DMS inhibits the secretion of IL-6/8(±s，pg/mL，n=3)

*P＜0.05 compared with 24 hours;#P＜0.05 compared with 48 hours.

time/hours IL-6 IL-8 24 68.65±4.91 92.07±2.44 48 53.41±4.99 83.45±4.88 72 52.24±1.67* 61.04±2.44*#

3 讨论

RA-FLS 异常过度增殖，分泌促炎性因子和蛋白激酶，参与RA的炎性反应，促进骨和软骨破坏。本研究证实DMS抑制RA-FLS增殖并明显抑制SPHK1蛋白的表达。提示DMS 在RA 中通过抑制SPHK1的表达而具有抗细胞增殖的潜能。

RA 致病过程中炎性因子IL-6和IL-8 等分泌增加。本研究发现，DMS 减少IL-6和IL-8的分泌，表明SPHK1 可能通过调控炎性反应参与RA 发病。体外研究发现，在胶原诱导的鼠关节炎动物模型中，应用DMS 能显著减轻关节炎性反应和骨质破坏[2]。应用SPHK1 活化后的下游代谢产物1-磷酸鞘氨醇可诱导RA-FLS 分泌IL-6和IL-8，促进基质金属蛋白酶的产生，进而导致软骨细胞和破骨细胞功能失调[3]，上述研究结果与本研究报道一致，说明调控SPHK1的表达，可能是延缓RA 关节进展和骨破坏的新靶点。SPHK1 调控RA-FLS增殖及IL-6和IL-8 分泌可能涉及多种信号通路，值得进一步探讨。

[1]Lai WQ，Chia FLA，Leung BP.Sphingosine kinase and sphingosine-1-phosphate receptors:novel therapeutic targets of rheumatoid arthritis?[J].Future Med Chem，2012，4:727-733.

[2]Lai WQ，Irwan AW，Goh HH，et al.Anti-inflammatory effects of sphingosine kinase modulation in inflammatory arthritis[J].J Immunol，2008，181:8010-8017.

[3]Zhao C，Fernandes MJ，Turgeon M，et al.Specific and overlapping sphingosine-1-phosphate receptor functions in human synoviocytes:impact of TNF-α[J].J Lipid Res，2008.49:2323-2337.