上调miRNA-205增强鼻咽癌细胞系CNE1的增殖和黏附

尹中普，孙 晓

(南阳市中心医院1.耳鼻喉头颈外科;2.消化内科，河南 南阳473003)

鼻咽癌是发生在鼻咽黏膜的一种恶性肿瘤，具有高度侵袭和转移的特性。鼻咽癌的发病涉及多个癌基因与抑癌基因的共同参与，通过癌基因和抑癌基因之间相互作用的失常，导致细胞的恶性增殖产生癌变，进而发生癌症。

miRNA 在肿瘤形成中发挥重要的作用[1]，主要参与了肿瘤细胞的增殖、凋亡和黏附等过程的调控。目前已经发现的miRNA 约有700多种，其中已有多项研究表明miRNA-205 在多种肿瘤细胞中高表达[2-3]，提示miRNA-205 可能是一种潜在的致癌基因。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样本收集:随机收集南阳市中心医院2012年5月至2014年1月原发性鼻咽癌组织样本41例，鼻咽炎黏膜组织样本38例和正常鼻咽黏膜组织样本43例。所有活体组织均经过病理学确诊，年龄＞18岁。所有样本获取时得到医院伦理委员会的同意。

1.1.2 试剂:鼻咽癌细胞系CNE1、DMEM 培养基、胎牛血清和LipofectamineTM2000(Invitrogen 公司);miRNA-205-mimic/inhibitor(上海吉玛制药技术有限公司合成);抗cyclin D1 和抗P21 抗体(Santa Cruz 公司)，其余试剂均为国产分析纯。

1.2 鼻咽黏膜组织中miRNA-205的mRNA表达:按照Trizol说明书操作。miRNA-205 上游引物:5'-CGTCCAACATTCC ACCG-3'，下游引物为5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3';β-actin:上游引物为5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'，下游引物为5'-ATTCGCACTGGATACGACCAGACTC-3'。

1.3 细胞培养、转染和分组:将CNE1 置于含10%胎牛血清的DMEM 培养液内，培养于37℃、5% CO2培养箱中。组别分为空白对照组(con);阴性对照组(negative control-mimics，NC-m 或negative control-inhibitor，NC-i);转染组(miRNA-205-mimics，205-m 或 miRNA-205-inhibitor，205-i)。按 LipofectamineTM2000 说明书操作，将miRNA-205-mimics/inhibitor转染到CNE1。

1.4 MTT 比色法测定细胞增殖曲线:于细胞处理结束前4 h，加入MTT 溶液，培养4 h，吸去培养液，加入DMSO，在酶联免疫检测仪570 nm 处测量吸光值(A570nm)，并绘制增殖曲线。

1.5 黏附实验:接种细胞于Fn 预包被的细胞培养板，静置15、30 和45 min后，收集黏附细胞，计算黏附百分率。

1.6 cyclinD1 和P21的蛋白表达:提取细胞蛋白，定量，取等量蛋白进行SDS-PAGE 电泳，转移至PVDF膜上，封闭液封闭1 h，加入一抗孵育，继而加入相应二抗孵育，荧光显色。

2 结果

2.1 RT-PCR检测各组织中miRNA-205的表达:鼻咽癌组织的miRNA-205表达比鼻咽炎组织和正常鼻咽黏膜组织高(P＜0.05)(图1，表1)

图1 各组织中miRNA-205的表达Fig1 miRNA-205 expression in various tissues

表1 各组织中miRNA-205的表达Table1 miRNA-205 expression in various tissues(±s，n=6)

表1 各组织中miRNA-205的表达Table1 miRNA-205 expression in various tissues(±s，n=6)

＊P＜0.05 compared with control group.

group miRNA-205 con(n=43)1.00±0.00 nasopharyngitis tissues (n=38) 1.07±0.04 nasopharyngeal carcinoma tissues (n=41) 5.89±0.18*

2.2 MTT 比色法测定增殖曲线:205-m 组细胞的增殖速度显著高于对照组(P＜0.05)，而205-i 组则显著低于对照组(图2)。

图2 CNE1 细胞转染miRNA-205-mimics/inhibitor后的增殖曲线Fig2 Effects of miRNA-205 on CNE1 cell proliferation(±s，n=6)

图3 CNE1 细胞黏附曲线Fig3 Adhesion curve of CNE1 cells (±s，n=3)

2.3 黏附实验:205-m 组细胞与对照组相比，30 和45 min后细胞的黏附效率均显著增加(P＜0.05)，而205-i 组则相反(图3)。

2.4 Cyclin D1 和P21的蛋白表达:与对照组相比，205-m 组中cyclin D1的表达显著增加，P21的表达却显著减少(P＜0.05)，而205-i 组结果相反(图4，表2)。

表2 Cyclin D1 和P21的蛋白表达Table2 Expression of cyclin D1 and P21 in CNE1(±s，n=6)

表2 Cyclin D1 和P21的蛋白表达Table2 Expression of cyclin D1 and P21 in CNE1(±s，n=6)

＊P＜0.05 compared with control group.

group cyclin D1 P21 con 1.00±0.00 1.00±0.00 NC-m 1.03±0.09 0.97±0.10 NC-i 0.98±0.05 0.99±0.07 205-m 4.32±0.39* 0.63±0.06*205-i 0.75±0.03* 3.42±0.21*

图4 Cyclin D1 和P21的蛋白表达Fig4 Western blot analysis of cyclin D1 and P21 in CNE1

3 讨论

本研究通过对鼻咽癌活检组织、鼻咽炎黏膜组织、正常鼻咽组织进行免疫印迹及反转录聚合酶链反应分析，发现鼻咽癌组织中miRNA-205的蛋白和mRNA 水平明显高于其他两组中的表达。过表达miRNA-205后，鼻咽癌细胞系CNE1增殖速率和黏附率增加，提示miRNA-205 可能参与了调控鼻咽癌的发生发展过程。此外，转染miRNA-205-mimics后，cyclin D1表达显著增加，而P21表达显著减少，提示miRNA-205 促进细胞系CNE1的增殖通过调控cyclin D1 和P21的表达来实现的。

综上所述，miRNA-205 在鼻咽癌细胞中表达增加，对鼻咽癌的发生发展及转移中发挥重要作用，可能起到癌基因的作用，但其具体机制还不清楚，后期需要进一步在体外和体内模型进行研究。

[1]He L，Hanno GJ.MicroRNAs:small RNAs with a big role in gene regulation[J].Nat Rev Genet，2004，5:522-531.

[2]Orang AV，Safaralizadeh R，Hosseinpour FMA.Insights into the diverse roles of miR-205 in human cancers[J].Asian Pac Cancer Prev，2014，15:577-583.

[3]Cai J，Fang L，Huang Y，et al.MiR-205 targets PTEN and PHLPP2 to augment AKT signaling and drive malignant phenotypes in non-small cell lung cancer[J].Cancer Res，2013，73:5402-5415.